穿破石對SOI模型大鼠NF-κB、MCP-1表達的影響

史彥飛，譚枚秀，徐 佳，劉奇英，廖 杏

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410005）

穿破石對SOI模型大鼠NF-κB、MCP-1表達的影響

史彥飛1，譚枚秀2*，徐 佳1，劉奇英2，廖 杏1

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410005）

目的 研究穿破石對輸卵管炎性阻塞性不孕癥（salpingitc obstructive infertility，SOI）模型大鼠核轉錄因子Kappa B（nuclear transcription factor Kappa B，NF-κB）、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)表達的影響。方法 采用金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和解脲支原體混合菌液接種法建立SOI大鼠模型。造模成功后，隨機分成穿破石低、中、高劑量組，婦炎康軟膠囊組，假手術組，模型組和空白組7組。予相應藥物治療30 d后，處死大鼠，取各組輸卵管組織觀察病理學改變，用免疫組化法檢測各組大鼠輸卵管組織中NF-κB、MCP-1的表達。結果 肉眼觀察，與模型組對比，穿破石低、中、高劑量組輸卵管腫脹、充血現象均有不同程度減輕，其中，穿破石高劑量組輸卵管結構較清晰。光鏡下，穿破石低、中、高劑量均不同程度地改善大鼠輸卵管組織炎癥反應，促進其病變上皮細胞增生修復，減輕內膜充血水腫。與正常組比較，模型組輸卵管組織中NF-κB、MCP-1表達明顯升高(P＜0.01)。與模型組比較，穿破石高、中、低劑量組輸卵管組織中NF-κB、MCP-1表達均明顯降低(P＜0.01)。結論 穿破石可促進受損組織與細胞的形態結構及其生理功能的恢復，其作用機制可能與抑制NF-κB的異常活化，從而抑制MCP-1的轉錄合成有關。

穿破石；輸卵管炎性阻塞性不孕；核轉錄因子Kappa B；單核細胞趨化蛋白-1

近年來，隨著人們生活、生育方式的改變及性傳播疾病的增加，女性不孕不育癥的病發率呈增長趨勢[1]，而輸卵管阻塞性不孕（salpingitc obstructive infertility，SOI）是導致女性不孕的首要因素，約占女性不孕因素的1/2[2]，嚴重降低女性生活質量，影響家庭和諧。通管方是名老中醫謝劍南教授總結多年經驗的有效驗方，匡繼林教授采用“通管方”為主治療輸卵管炎性不孕60例，總有效率、治愈率分別達91.7%，50%[3]。而穿破石在通管方中劑量最大，活血化瘀、通經活絡，是為君藥。據此，本實驗擬以SD大鼠為SOI模型，探討其對SOI模型大鼠核轉錄因子Kappa B （nuclear transcription factor Kappa B，NF-κB）、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)表達的影響，以期為研發中藥新藥治療SOI奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性SD大鼠62只，SPF級，體質量（180～200） g，由長沙斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號:SYXK（湘）2013-0005，飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心。

1.2 藥品及試劑

婦炎康軟膠囊（深圳市佳泰藥業股份有限公司，批號161005），穿破石配方顆粒（廣東一方制藥有限公司，批號6075082），兔抗鼠NF-κB多克隆抗體（購自武漢博士德生物工程有限公司），MCP-1試劑編號BA1254試劑 （購自武漢博士德生物工程有限公司），金黃色葡萄球菌（Staphyloccocusaureus，菌種號 ATCC25923），大腸桿菌（Escherichia coli，菌種號ATCC25922），由湖南中醫藥大學免疫與微生物教研室提供，解脲脲原體（M.urealyticum，菌種號52022），由湖南中醫藥大學第二附屬醫院檢驗科細菌室提供。

1.3 主要儀器

JY3002型電子天平（上海精密科學儀器有限公司），HHS-2電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海南陽儀器有限公司），LEICA DM LB2型雙目顯微鏡 （德國LEICA公司），Haier醫用微波爐 （Haier集團），MIAS醫學圖象分析系統（北航公司產），S2-93自動雙重純水蒸餾器 （上海亞榮生化儀器廠），Shandon325型石蠟切片機 （英國Shandon公司），DNP-9162型電熱恒溫培養箱 （上海精宏實驗設備有限公司），Motic B5顯微攝像系統（麥克奧迪實業集團公司）。

1.4 造模方法

[4]方法，并加以改進。將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、解脲脲原體按1∶1∶1比例用無菌生理鹽水配成5×108/mL的混合液。用注射器分別抽取等體積的混合菌液，注入無菌培養皿中，混合均勻。將醫用明膠片剪成0.5 cm×0.5 cm大小，置于注有混合菌液的培養皿中，與混合菌液充分接觸。待明膠充分飽和，一手持鼠尾，將大鼠倒立，另一手夾含混合菌液的明膠海綿經陰道塞至大鼠宮腔內，左右各塞1塊，并保持鼠倒立1～2 min，隔天1次，連續 8次。假手術組按相同方法塞入不含菌液的明膠海綿。造模結束30 d后，隨機從空白組、假手術組、模型組各抽取2只大鼠，檢驗造模是否成功。

1.5 分組與給藥

將成功建立的模型組大鼠按隨機數字表法隨機分為7組，每組8只。穿破石組低、中、高劑量分別以1.62 g/（kg·d）、3.24 g/（kg·d）、6.48 g/（kg·d）濃度灌胃，婦炎康軟膠囊組以 1.62 g/（kg·d）濃度灌胃，模型組、空白組及假手術組分別給予蒸餾水灌胃，灌胃容量 10 mL/kg，1 次/d，連續 30 d。

1.6 組織標本的處理

麻醉大鼠，腹腔采血后，解剖大鼠，肉眼觀察輸卵管形態，取大鼠雙側輸卵管組織，用4%多聚甲醛固定，常規脫水、石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察輸卵管組織的病理學改變。

1.7 輸卵管組織NF-κB、MCP-1表達的檢測

免疫組化法檢測NF-κB、MCP-1的表達脫蠟、水化組織切片，對組織切片進行預處理，3%H2O2去離子水孵育1 min；PBS沖洗，2 min×3次；滴加一抗，37 ℃孵育 2 h，PBS 沖洗，2 min×3次；滴加試劑Polymer Helper，37 ℃孵育 20 min，PBS 沖洗，2 min×3次；滴加試劑Polymeroxidase-anti-mouse/rabbitIgG，37 ℃孵育 20 min，PBS沖洗，2 Vmin×3次； 應用DAB溶液顯色；自來水充分沖洗、復染、脫水、透明、封片。在200倍光鏡下，每張切片隨機檢測3個視野，使用高清晰度彩色醫學圖像分析系統評價NF-κB、MCP-1蛋白表達水平。

1.8 統計學處理分析方法

采用SPSS 20.0統計分析軟件進行數據處理，各組數據“±s”表示，首先進行方差齊性檢驗，若呈正態分布，則采用單因素方差分析及多重比較，若呈非正態分布，則采用秩和檢驗。P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 肉眼下觀察輸卵管組織

正常組、假手術組大鼠輸卵管大小、形態正常，結構清晰，漿膜無明顯充血及水腫，與盆腔周圍組織無粘連。模型組大鼠輸卵管組織明顯腫脹、充血，結構扭曲，與卵巢及周圍組織粘連緊密不易分離，部分可見積水或積膿。給予穿破石治療后，低劑量組大鼠輸卵管增厚，組織粘連，部分輸卵管可見積水或積液；中劑量組大鼠輸卵管輕微增厚，輕微組織粘連，少部分可見少許積液；高劑量組大鼠輸卵管部分輕微增厚，偶可見輕微組織粘連及少許積液。婦炎康軟膠囊組大鼠輸卵管輕微增厚，部分組織粘連。

2.2 光鏡下觀察輸卵管組織

正常輸卵管壁由黏膜層、肌層、漿膜層三層構成。黏膜層主要由單層纖毛柱狀上皮細胞組成。空白組和假手術組大鼠輸卵管管壁組織結構清晰，黏膜上皮細胞排列整齊，纖毛豐富，管腔通暢。模型組大鼠輸卵管管壁結構分界不清，黏膜上皮細胞排列紊亂，呈卵圓形，可見裸露的細胞核，表面纖毛缺失，黏膜皺襞增寬、消失，壞死組織溶解吸收，大量炎性細胞浸潤，大量結締組織增生。給予婦炎康軟膠囊治療后，輸卵管黏膜上皮細胞排列欠規整，少量纖毛脫落，可見纖維組織增生。給予穿破石治療后，低劑量組大鼠輸卵管壁各層結構分層不明顯，纖毛脫落，炎性細胞浸潤，少量結締組織增生；中劑量組大鼠輸卵管黏膜上皮細胞排列尚整齊，纖毛少量脫落；高劑量組大鼠輸卵管管壁組織結構尚清晰，纖毛存在，管腔通暢，少量炎性細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠輸卵管組織病理變化光鏡圖（HE×200）

2.3 大鼠輸卵管組織NF-κB、MCP-1的表達

空白組與假手術組差異無統計學意義，與模型組存在顯著性差異（P＜0.01），提示 SOI大鼠模型復制成功；經治療后，婦炎康軟膠囊組、穿破石低、中、高劑量組與模型組比較，NF-κB、MCP-1表達均明顯降低（P＜0.01），與婦炎康軟膠囊組比較，穿破石低、高劑量組 NF-κB 表達降低（P＜0.05），MCP-1 表達降低（P＜0.01，P＜0.05）。 見表 1。

表1 各組大鼠輸卵管組織NF-κB、MCP-1表達的比較（±s，μm）

表1 各組大鼠輸卵管組織NF-κB、MCP-1表達的比較（±s，μm）

注：與模型組比較，**P＜0.01；與婦炎康軟膠囊組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別空白組假手術組模型組婦炎康軟膠囊組穿破石低穿破石中穿破石高F值n 8 8 8 8 8 8 8 NF-κB 0.21±0.02**△△0.21±0.03**△△0.39±0.03△△0.28±0.04**0.31±0.03**△0.28±0.03**0.24±0.04**△35.483 MCP-1 0.16±0.03**△△0.17±0.03**△△1.31±0.07△△0.60±0.04**0.66±0.07**△0.61±0.03**0.22±0.02**△△66.886

3 討論

本研究建立經陰道塞入含有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、解脲脲原體的混合菌液明膠致炎模型，避免了傳統細菌感染致炎法、機械刺激加細菌感染致炎法對實驗的干擾，模擬人類生殖道上行性感染病程遷延導致的慢性炎癥。模型動物顯示：輸卵管增粗肥大，與卵巢及周圍組織粘連緊密不易分離，病理檢驗示輸卵管各層特別是黏膜層均有廣泛的淋巴細胞及漿細胞浸潤，上皮細胞增生肥大；免疫組化示大鼠輸卵管組織中NF-κB、MCP-1表達顯著升高，提示SOI模型復制成功。

NF-κB是調節趨化因子、黏附分子等表達的重要轉錄因子，參與炎癥過程中的多種信號傳導途徑，主要趨化單核細胞和T淋巴細胞，誘導單核細胞、內皮細胞表達黏附分子，使各種細胞尤其是單核細胞向病變部位聚集[5]，從而擴大炎癥反應[6]，其可有效反映炎性狀態造成的機體損傷，因此檢測價值也較高[7-8]。目前認為，MCP-1是介導單核巨噬細胞浸潤的主要因子，而MCP-1的轉錄合成是由NF-κB調控的。MCP-1的基因啟動子和增強子序列存在NF-κB的結合位點。因此，NF-κB的異常活化可能是引起MCP-1表達增加的主要因素。本研究結果顯示：模型組大鼠輸卵管組織中NF-κB、MCP-1水平均顯著高于正常對照組及假手術組（P＜0.01），表明在SOI中機體炎癥因子平衡被打破，導致炎癥的發生和發展，引起組織損傷和纖維增生。予穿破石治療后，大鼠輸卵管組織中NF-κB、MCP-1水平均有降低，使各炎癥因子恢復到接近正常水平，與婦炎康軟膠囊組相比，穿破石組大鼠炎癥因子的恢復情況效果更優（P＜0.05）。

通管方是臨床上治療輸卵管阻塞性炎性不孕癥的有效方，穿破石作為通管方之君藥，具有活血化瘀、通經活絡之功效。實驗研究發現，以穿破石為君藥的通管方有良好的抗炎、抑菌及抑制解脲支原體生長的作用[9]。現代藥理學研究亦發現，穿破石對實驗動物模型具有顯著的鎮痛抗炎作用[10]，但其作用機制尚不明確。穿破石中富含黃酮、多糖等多種化學成分[11]，而程健等[12]研究證實黃酮類化合物可通過對NF-κB信號通路的抑制作用來抑制前炎癥基因的表達，緩解炎癥的發生發展。目前，國內對穿破石作用機制的研究較少，尤其是關于慢性輸卵管阻塞性不孕的動物實驗和臨床研究。本研究發現，穿破石可有效抑制大鼠輸卵管組織炎癥反應，促進其病變上皮細胞增生修復，減輕漿膜充血水腫，顯著降低輸卵管組織中NF-κB、MCP-1的表達，其具體作用機制有待進一步研究。

參考文獻:

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（本文編輯 楊 瑛）

Effects of Chuanposhi on the Expression of NF-κB and MCP-1 in SOI Model Rats

SHI Yanfei1,TAN Meixiu2*,XU Jia1,LIU Qiying2,LIAO Xing1
(1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410005,China)

Objective To study the effect of Chuanposhi on NF-κB and MCP-1 level in rats with salpingitc obstructive infertility(SOI).Methods The SOI rat models were established by mixed bacteria suspension inoculation method of Staphyloccocus aureus,Escherichia coli and Ureaplasma urealyticum.The successful model rats were randomly divided into 7 groups including high,middle and low dosage ofChuanposhigroups,Fuyankang softcapsule group,sham-operation group,blank group.The model rats were killed after treatment with corresponding medicines for 30 days.Pathologic changes of fallopian tube were measured by a microscope.The NF-κB and MCP-1 levels in SOI model rats were measured by immunohistochemical method.Results Visual inspection:the tubal swelling and hyperemia in high,medium and low dosage of Chuanposhi groups reduced in different degrees compared with those in the model group,and the structures in high dosage of Chuanposhi group were clear.Light microscopic inspection:the low,medium and high dosage of Chuanposhi could improve the oviduct tissue inflammation of rats in different degrees,promote its lesion repair of epithelial cell proliferation,alleviate congestion and edema.The expressions of NF-κB and MCP-1 in model group were markedly higher than those in normal control group (P＜0.01).The expressions of NF-κB and MCP-1 in high,medium,low dosages of Chuanposhi groups model group weresignificantly lower than those in the model group (P＜0.01).Conclusion Chuanposhi could promote the recovery of morphology and physiological function of damaged tissues and cells.Its mechanism may be associated with inhibiting the NF-κB abnormal activation and preventing the transcription of MCP-1 synthesis.

Chuanposhi;salpingitc obstructive infertility;nuclear transcription factor Kappa B;monocyte chemotactic protein-1

R285.5;R271.14

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.09.005

本文引用：史彥飛，譚枚秀，徐 佳，劉奇英，廖 杏.穿破石對SOI模型大鼠NF-κB、MCP-1表達的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（9）：939-942.

2017-02-21

湖南省中醫藥管理局課題（2015115）。

史彥飛，女，在讀碩士研究生，研究方向：中西醫結合防治不孕不育癥。

* 譚枚秀，女，教授，碩士研究生導師，E-mail：2373705848@qq.com。