熒光微球免疫層析技術定量檢測河鲀毒素

張世偉，王士峰，姚添琪，楊國武，賴心田

熒光微球免疫層析技術定量檢測河鲀毒素

張世偉，王士峰，姚添琪，楊國武，賴心田

（深圳市計量質量檢測研究院，廣東 深圳 518102）

建立河鲀毒素的熒光微球免疫層析檢測方法。基于抗體親和位點保護標記方法制備抗河鲀毒素抗體偶聯熒光微球，方法簡單穩定，所有結合分離步驟均在親和柱中完成，避免了親和位點被破壞而且熒光信號更強，將檢測靈敏度提高至原來的8 倍左右。所建立的河鲀毒素檢測方法IC50為18.4 ng/mL，線性范圍為2～200 ng/mL（y =-0.15ln x+0.95，R2=0.98）。檢測河鲀樣本的最低檢出限為10 μg/kg，平均相對標準偏差小于25%（n=6）。該方法適用于熱加工樣品的檢測，整個檢測過程僅需15 min，且無需使用大型設備，為河鲀餐前速測提供了一定技術手段。

河鲀毒素；親和位點保護；熒光微球；免疫層析

河鲀毒素（tetrodotoxin，TTX）是一種劇毒的天然非蛋白質類神經毒素，分布廣泛，不僅存在河鲀魚中，也存在于其他海洋動物體內，如織紋螺，是已知毒性最強的海洋生物毒素之一[1]。它通過對鈉離子通道的阻斷作用而抑制神經沖動的傳導，使感覺神經麻痹，四肢癱瘓，呼吸困難，最后因呼吸抑制而死亡，其毒力比氰化鈉大1 000 倍，人畜誤食后均能致死[2-4]。

由于河鲀肉味鮮美，營養豐富，因此被人們視為美味，尤其在亞洲國家，人們自古就有嗜吃河鲀的習慣。近年來主要東方鲀品種（如暗紋東方鲀、紅鰭東方鲀等）的人工繁殖和苗種培育的成功，加速推進了我國河鲀人工養殖的發展，產量和外銷量不斷增加。目前我國養殖的河鲀已占世界河鲀產量的70%，每年大量外銷日本、韓國等國，河鲀已成為我國一種具有較高經濟價值和發展潛力的特色水產品。河鲀體內含有的TTX化學性質穩定，一般烹調手段難以破壞，中毒后也缺乏有效的解救措施，嚴重威脅到消費者的食用安全，因此河鲀加工時必須完全去除毒性富集部位，如內臟、眼球、表皮。盡管加工河鲀有著嚴格的規定，TTX中毒的案例仍然時有發生[5-7]。解決這一問題的方法就是建立TTX的前端預警體系，在消費者食用前對所加工的河鲀進行毒性速測。

免疫學檢測技術的快速發展為小分子海洋毒素的快速檢測提供了良好的技術基礎[8-11]。Kawatsu等[12]曾以甲醛作為交聯劑合成了TTX人工抗原并首次制備了TTX單克隆抗體。劉燕婷等[13]采用戊二醛作為交聯劑制備了TTX抗原，但并未見后續檢測方法的報道。Ling Sumei等[14]建立了TTX的酶聯免疫吸附法快速檢測方法，靈敏度達到5 ng/mL，使TTX免疫學檢測方法達到了實際應用的要求。然而，酶聯免疫吸附法檢測步驟仍然較為繁瑣，無法應用于現場速測。目前TTX的現場速測主要采用膠體金免疫層析法，但其靈敏度較差。熒光素作為抗體標記物能有效的放大免疫反應信號，與膠體金標記相比靈敏度提高了10～100 倍[15-18]。然而，其容易被食品中的基質干擾，目前成功商品化的食品免疫熒光檢測試劑仍然較少。近年來興起的熒光微球材料（fluorescent microspheres，FM）為提高免疫層析靈敏度提供了新的解決方案，其通過將熒光素包裹在熒光微球中，避免了基質和熒光素的近距離接觸，從而避免了熒光信號的淬滅[19-22]。本研究采用熒光微球標記的免疫層析技術，提高了TTX免疫層析技術的靈敏度，使其能實際用于TTX的現場速測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硝酸纖維膜（NC膜）、熒光硅球墊、樣品墊、吸水紙及PVC底板 美國Millipore公司；FluoSpheres?羧基修飾的熒光微球（直徑0.2 μm、激發波長540 nm、發射波長560 nm）、AminoLink Plus Immobilization Kit 美國Thermo公司；TTX 成都曼斯特生物科技公司；大田軟海綿酸、石房蛤毒素、微囊藻毒素、雙鞭甲藻毒素、軟骨藻酸 日本和光純藥工業株式會社。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

XYZ3100點膜儀 美國Bio-Dot公司；試紙條讀取儀深圳市三方圓生物科技有限公司；Milli-Q水處理系統美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 TTX抗體制備

以Zhou Jie等[23]報道的甲醛交聯法合成TTX抗原，單克隆抗體制備參照文獻[24]報道的方法。采用辛酸硫酸銨純化抗體。

1.3.2 TTX抗體-熒光微球偶聯物的制備

采用保護親和位點法標記熒光微球，標記流程如圖1所示。使用AminoLink Plus Immobilization Kit將TTX偶聯于含醛基活化的瓊脂糖凝膠上后，用氰基硼氫化鈉還原所形成的不穩定碳氧雙鍵，具體操作步驟見試劑盒說明書。將2 mL 5 mg/mL的TTX抗體和2 mL上述偶聯完成的瓊脂糖凝膠混合，室溫孵育10 min后，裝入離心柱，離心去除為結合的抗體，使用6 mL 0.01 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）分3 次洗滌凝膠。0.2 mg的熒光微球加入到2.7 mL、0.01 mol/L PBS中，加入1.0 mg 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺進行活化，然后加入含瓊脂糖凝膠的離心柱中，渦旋混勻，靜置室溫孵育1 h后離心去除液體。使用4 mL 0.1 mol/L pH 3.0的甘氨酸鹽酸緩沖液作為洗脫液分兩次淋洗瓊脂糖凝膠。洗脫液立即用0.1 mol/L氫氧化鈉調節至pH 7.0，得到標記好的TTX抗體-熒光微球偶聯物。同時，按傳統的標記方法，分別以投料比為1∶10、1∶30、1∶100標記熒光微球[25]。偶聯后的抗體分別使用下述不同配方的熒光抗體稀釋液稀釋用于試紙條 制備：

配方1：pH 7.4，0.01 mol/L PBS，含2%果糖、1%聚乙二醇標準品（polyethylene glycol，PEG）40000、5%蔗糖、1%牛血清白蛋白（albumin bovine serum，BSA）、0.4%吐溫-20[26]；配方2：pH 7.4，0.01 mol/L PBS，含2%果糖、1% PEG 40000、5%蔗糖、BSA、0.4%吐溫-20、0.1% NaN3；配方3：pH 7.4，0.01 mol/L PBS，含5%海藻糖、1% PEG 40000、1% BSA、0.4%吐溫-20、0.1% NaN3；配方4：pH 7.4，0.01 mol/L PBS，含5%海藻糖、1% PEG 40000、1% PVP K-40、1% BSA、0.4%吐溫-20、0.1% NaN3；配方5：pH 7.4，0.01 mol/L PBS，含5%海藻糖、0.2%精氨酸、1% PEG 40000、1% PVP K-40、1% BSA、0.4%吐溫-20、0.1% NaN3。

圖1 抗體親和位點保護標記流程Fig. 1 Schematic illustration of the binding site protection procedure for antibody

1.3.3 熒光試紙條的制備

熒光試紙條結果如圖2所示。首先將樣本墊浸泡于20 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.4，含1.0% BSA，0.25% Tween-20、1% PVP K-40、0.5% PEG 40000和0.1% NaN3）中，于60 ℃干燥2 h；將TTX-BSA偶聯物（2.5 mg/mL）和羊抗鼠多抗（0.3 mg/mL）噴涂于NC膜上，分別作為TTX試紙條檢測線（T線）和質控線（C線），于37 ℃真空干燥12 h。結合墊噴有TTX抗體偶聯熒光微球，室溫真空干燥12 h。最后將吸水紙、NC膜、結合墊和經過預處理的樣本墊順序粘貼在PVC底板上，用自動切條機切成4 mm寬的試紙條，室溫條件下真空干燥，備用。

圖2 熒光微球免疫層析試紙檢測原理示意圖Fig. 2 Schematic illustration of detection of TTX by microsphere-based fl uorescence immunochromatographic strip

1.3.4 定量曲線的建立

將陰性條件下T線熒光信號/C線熒光信號（FIT/FIC）值記為B0，TTX標準溶液的FIT/FIC記為B，以B/B0為縱坐標，TTX標準溶液質量濃度的對數為橫坐標，使用Origin 8.0建立四參數擬合曲線。以B/B0在0.2～0.8的標準點建立基于最小二乘法的線性回歸方程。

1.3.5 方法穩定性評價

選取色譜確證為TTX陰性的黑鰓兔頭鲀肉樣，TTX加標量為0.5 mg/kg。使用同批和不同批次熒光試紙條連續6 d對加標和未加標樣品其進行測定。

1.3.6 真實樣品的方法比對

取1 g均質的河鲀組織，加入4 mL 0.01 mol/L pH 7.4的PBS，渦旋振蕩2 min，0.45 μm過濾上清液，取上清液0.1 mL滴加至熒光免疫層析試紙的樣品墊，10 min后讀取結果。液相色譜法為GB/T 23217—2008《水產品中河鲀毒素的測定 液相色譜-熒光檢測法》所規定的方法[27]。

2 結果與分析

2.1 標記方法的對比

抗體的熒光微球標記一直是建立熒光免疫層析方法的重點也是實驗難點。熒光微球和抗體的投料比過高會導致抗體活性的喪失，而過低則影響熒光信號強度，均會導致檢測靈敏度的降低，因此，過去一直需要摸索一系列的投料比，工作量非常大且結果不穩定，試劑的批間差較大。本研究建立的保護抗體親和位點標記法，將抗體親和于固定化抗原的瓊脂糖凝膠上，保護了抗體活性位點，再加入超過量的活化熒光微球，在抗體上盡可能地標記上熒光微球，從而在不影響抗體活性的基礎上，大大增加了抗體的熒光信號，并且由于熒光微球和抗體的投料比超過量，因此每批制備的標記抗體熒光信號均一。圖3對比了本研究建立的抗體活性位點保護標記法和傳統標記方法對檢測靈敏度的影響。傳統方法考察了3 個投料比，其中1∶30獲得了最佳的靈敏度，其IC50為156 ng/mL。而本研究使用的方法IC50為18.4 ng/mL，靈敏度提高至原來的8 倍左右。該方法標記洗脫后的親和柱可重復使用4～5 次，過量加入的熒光微球離心回收后可繼續使用，大大降低了標記成本。本課題組使用該策略還進行了抗體的酶標記和生物素標記，均取得了良好的效果。

圖3 不同標記方法標記抗體的熒光免疫層析標準曲線（n=6）F ig. 3 Representative detection standard curves for different labeled antibodies (n = 6)

2.2 檢測方法參數

圖4 肉眼觀察TTX熒光微球免疫層析條抑制情況Fig. 4 Inhibition of TTX fl uorescent immunochromatography observed by naked eye

基于保護標記的熒光微球標記抗體所建立的免疫層析方法，其檢測不同質量濃度TTX的試紙條在580 nm激發波長下如圖4所示。根據圖3計算其線性范圍為2～200 ng/mL（R2＞0.98），回歸方程為y = -0.15lnx+0.95（R2= 0.98）。如表1所示，該方法與各海洋毒素的交叉反應率小于1.0%，特異性良好。以線性范圍的最低點2 ng/mL乘以其樣本前處理稀釋倍數5得到其最低檢出限為10 μg/kg。

表1 與各 海洋毒素的交叉反應率Table 1 Cross-reactivity of antibody with marine toxins

2.3 熒光抗體稀釋液配方對試劑有效期的影響

熒光免疫層析技術由于靈敏度比傳統的膠體金免疫層析方法大大提高，被越來越多地用于體外診斷領域。然而，食品樣品基質比臨床樣本更加復雜，直接標記熒光素容易被基質干擾導致信號的淬滅。近年來，隨著商品化的熒光微球的上市，為熒光免疫層析技術在食品檢測領域的應用提供了有效的工具。熒光微球通過將大量的熒光物質包裹于聚合物材料中，表現出更高的熒光強度，并且能有效防止基質對熒光信號的干擾，提高了熒光物質的光學穩定性[28]。然而由于其顆粒直徑為膠體金顆粒的10～100 倍，這種大直徑的顆粒長期放置后容易聚集并吸附在結合墊上，無法有效地層析。目前常用的策略是將熒光微球標記的抗體另外加入于酶標孔中，臨用時手動混勻，使用較為不便[29]。本研究將熒光抗體噴在結合墊上，并置于樣品墊前端（圖2），考察了5 個配方熒光抗體稀釋液對試劑有效期的影響（圖5）。配方1為目前較為通用的熒光抗體稀釋液配方，然而將其噴于結合墊后，熒光信號大幅度衰減，在配方2加入防腐劑和在配方3加入海藻糖保護抗體后，雖然結果有所提高，但仍然不能滿足商品化要求。觀察試紙條后發現，熒光微球在結合墊形成了無法層析的沉淀。配方4加入1%的PVP K-40提高熒光微球的分散性，6 個月后的熒光信號大幅度提高。配方4加入了0.2%的精氨酸保護熒光信號，使其6 個月的熒光衰減小于30%，基本滿足商品化條件。

圖5 熒光抗體稀釋液對熒光信號衰減的影響Fig. 5 Infl uence of fl uorescent antibody diluents on fl uorescent signal reduction

2.4 方法穩定性評價

本研究需用同批次和不同批次（實驗當天制備）的試紙條對同一樣品進行測定，陰性樣品均為未檢出，檢測添加樣品的結果見表2。同批次的試紙條6 d內的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為11%，不同批次的RSD為16%。回收率均在60%～100%之間，平均回收率為78%，能對河鲀中的TTX進行有效的餐前監控。

表2 TTX熒光試紙的批內、批間的RSDTable 2 Intra- and inter-assay variations of TTX test strip

2.5 真實樣品檢測結果

表3 2 種方法檢測河鲀魚組織中TTX含量（n=6）Table 3 Comparison of TTX contents in puffer tissue determined by two methoddss (n=6)mg/kg

從市場隨機購買野生的黑鰓兔頭鲀和養殖的暗紋東方鲀，用本研究建立的熒光免疫層析法和GB/T 23217—2008規定的液相色譜法對其肌肉、肝臟、皮中的TTX進行檢測（表3）。在野生黑鰓兔頭鲀的肌肉、肝臟、皮以及養殖暗紋東方鲀的肝臟中，上述兩種方法均檢出TTX。低質量濃度下熒光免疫層析法和液相色譜法符合性較好，相對誤差低于20%（以液相色譜法結果作為真值），高質量濃度下則偏離較大，其原因在于本研究所使用的前處理方法僅使用PBS一步提取，而TTX在PBS中微溶，導致高質量濃度下大部分TTX不能轉移進提取液。據文獻報道，河鲀魚有無毒的判定閾值為1.65 mg/kg，在此閾值附近，熒光免疫層析法的相對誤差低于30%（以液相色譜法結果作為真值），而該方法檢測實際樣品的RSD小于25%[30]，因此，作為快速初篩方法，該技術可現場10 min內判斷樣品是否有TTX中毒風險。本研究還使用建立的熒光免疫層析法對沸水浴處理10 min后的野生黑鰓兔頭鲀肌肉進行檢測，仍能檢測到0.037 mg/kg的TTX，說明該方法也可適用于生產和餐飲環節熱加工河鲀產品的檢測。

2016年9月7日，我國發布了《關于有條件放開養殖紅鰭東方鲀和養殖暗紋東方鲀加工經營》的通知，先行放開了養殖紅鰭東方鲀和暗紋東方鲀的加工和銷售。本研究對養殖的暗紋東方鲀的肌肉、肝臟、皮進行了檢測，僅肝臟檢出微量毒素，但遠低于中毒風險的閾值。可見該項政策的出臺是基于河鲀去毒養殖技術已達到一定水平的背景下做出的，是科學合理的。然而，河鲀去毒養殖對水體、環境、飼料投放的要求較高，為防止未達到規范要求的公司或個人進行河鲀養殖及銷售，對市售河鲀的風險調查仍然不可放松。

3 結 論

本研究基于抗體親和位點保護標記方法制備的抗TTX-熒光微球，具有親和力好、熒光強度大、批間差異小等優點，從而將TTX的檢測靈敏度提高至原來的8 倍左右。并且研究了熒光抗體稀釋液配方，使熒光標記抗體一體式組裝在測試卡上6 個月熒光衰減小于30%，從而使該技術能夠以測試卡的形式商品化應用。配合簡單的一步提取前處理方法，整個檢測過程僅需15 min，且無需使用大型設備，從而彌補了河鲀中TTX餐前現場監測技術的短板。

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Microsphere-Based Fluorescence Immunochromatographic Assay for Quantitative Detection of Tetrodotoxin

ZHANG Shiwei, WANG Shifeng, YAO Tianqi, YANG Guowu, LAI Xintian
(Shenzhen Academy of Metrology and Quality Inspection, Shenzhen 518102, China)

A microsphere-based fluorescence immunochro matographic assay was established for the detection of tetrodotoxin. A binding site prote ction procedure was developed for antibody labeling with fl uorescent microspheres, which prevented damage to the antibody binding site and consequently enhanced the fl uorescence signal. The whole process of binding and separation was effi ciently completed on an affi nity spin column. The sensitivity of the antibody-microsphere conjugate was nine times higher than that prepared by direct labeling. The immunochromatographic assay exhibited a linear range from 2 to 200 ng/mL for the detection of tetrodotoxin (y = -0.15lnx + 0.95, R2= 0.98) with an IC50of 18.4 ng/mL. The limit of detection (LOD) for tetrodotoxin was 10 μg/kg in puffer with an average relative standard deviation ( RSD) of less than 25% (n = 6). The assay method could be applied on heat-processed products without the need for large-scale equipment.The whole analysis process took only 15 min for each sample.

tetrodotoxin; binding site protection; fl uorescent microspheres; immunochromatography

TS207.3

A

1002-6630（2017）20-0312-06

張世偉, 王士峰, 姚添琪, 等. 熒光微球免疫層析技術定量檢測河鲀毒素[J]. 食品科學, 2017, 38(20)∶ 312-317.DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720046. http∶//www.spkx.net.cn

ZHANG Shiwei, WANG Shifeng, YAO Tianqi, et al. Microsphere-based fluorescence immunochromatographic assay for quantitative detection of tetrodotoxin[J]. Food Scien ce, 2017, 38(20)∶ 312-317. (in Chinese with English abstract)DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720046. http∶//www.spkx.net.cn

2016-10-08

深圳市科技計劃項目（JCY20150626104807916）

張世偉（1985—），男，高級工程師，碩士，研究方向為食品質量安全。E-mail：zsw_8506@163.com

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720046