分子熒光差異加標法快速測定蛋黃中VB2的含量

高向陽，張 娜，郭楠楠，岳希舉，魏 龍

分子熒光差異加標法快速測定蛋黃中VB2的含量

高向陽，張 娜，郭楠楠，岳希舉，魏 龍

（鄭州科技學院食品科學與工程系，河南 鄭州 450064）

為建立一種快速、簡便定量測定生物樣品中VB2的新型分析方法，以雞蛋黃為樣品，用分子熒光差異加標法測定。結果表明：雞蛋黃樣品中VB2的含量為402 μg/100 g，相對標準偏差不大于1.5%（n=6）；加標回收率為92.0%～104%；檢出限為5.76×10-3μg/mL，定量限為1.92×10-2μg/mL。該法在實驗條件完全相同的情況下測定，扣除了背景干擾，不需繪制工作曲線和過柱去雜質，快速、準確、簡便、實用，是適合VB2測定的新型分析技術。

分子熒光；差異加標法；雞蛋黃；VB2

雞蛋黃含有豐富的ω-3不飽和脂肪酸、蛋白質、鈣、磷、鐵等礦物質[1-2]和VB2，ω-3不飽和脂肪酸可減少腦血栓的形成，有提高人體自身免疫的作用[3-4]。VB2又稱核黃素，紫外線照射下可光解為光黃素[5-6]，是動物和人體維持正常機體功能的營養物質，因不會在人體蓄積，需及時通過蛋黃、牛奶、黃豆、酵母等膳食進行補充。人體缺乏核黃素時，代謝容易發生障礙[7]，所以，蛋黃是人類良好的主要輔助食品。

目前，VB2的測定方法有核磁共振法[8-9]、高效液相色譜法[10-14]、化學發光法[15-18]、電化學法[19-20]、離子色譜法[21]、質譜法[22-24]、超臨界流體色譜[25]、共振光散射法[26]、分光光度法[27]等。這些方法大多數儀器昂貴、成本較高，需要配制5～7 個標準系列溶液用標準曲線法進行定量，耗費時間且存在作圖誤差；由于標準溶液與樣品試液本底背景常存在較大差異，若試液本底對測定信號產生無法排除的干擾，測定準確度會降低；標準曲線繪制時的溫度、濕度、大氣壓、儀器等測定條件與樣品試液測定時常有極大不同，當用之前繪制的標準曲線測定當前的樣品結果時，試液與標準溶液無法實現同步同條件實時測定，不可避免會引入一定誤差。因此，標準曲線常需要重新繪制或者校正，過程繁瑣，給工作帶來不便；如果不能及時扣除不同樣品的不同本底，所有樣品使用同一個標準工作曲線，樣品間的測定結果缺乏可比性。

分子熒光法靈敏度高，是一種痕量分析技術，但用于測定生物樣品中VB2時，有基體共存蛋白質等背景的干擾[28-30]，因此，減少熒光污染、扣除環境因素和試液背景的干擾對準確、快速測定VB2具有重要意義。分子熒光差異加標法測定VB2鮮見文獻報道，雞蛋黃基體成分復雜，定量分析時，無論是采用傳統的標準曲線法還是比較法，均易受到共存蛋白質的干擾和各種熒光污染的影響，帶來一定的測定誤差。分子熒光差異加標法是在完全相同的試液背景條件下加入不同量的標準溶液后測定被測物質，能有效的扣除背景，消除基體熒光和可能光解等副反應的干擾。該法操作簡便，快速準確，成本較低，且無需繪制工作曲線和過柱除雜，工作效率得到極大提高，適用于基體較為復雜的蛋黃等生物樣品中VB2含量的測定，具有一定的推廣應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮雞蛋，2016年11月購于鄭州市好又多超市，及時處理 和測定。

VB2標準品（CAS編號83-88-5，純度≥99%） 上海金穗生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（食品級） 南寧龐博生物工程有限公司；低亞硫酸鈉（分析純） 天津市致遠化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

YXQ-SG 41-280A高壓蒸汽滅菌鍋 開封大河機電廠；970CRT熒光分光光度計、PXSJ-216離子計 上海儀電科學儀器股份有限公司；SYZ-135型石英亞沸高純水蒸餾器 金壇市杰瑞爾電器有限公司；BS-224S型電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

10 g/L木瓜蛋白酶用2.5 mol/L乙酸鈉溶液配制，現用現配；20 g/100 mL低亞硫酸鈉溶液現用現配，保存于冰水浴中，4 h內有效。25 μg/mL VB2標準儲備液配制：準確稱取于真空干燥器中干燥24 h的VB2標準品50.0 mg，置于2 L容量瓶中，加入2.4 mL冰乙酸和1.5 mL水，溶解后定容，移至棕色試劑瓶中，加少許甲苯于表面，4 ℃冰箱中保存。1 μg/mL VB2標準使用液配制：吸取25 μg/mL VB2標準儲備液2.00 mL，置于50 mL棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，避光保存于4 ℃冰箱。所用水為二次石英亞沸重蒸高純水。

1.3.2 樣品預處理

隨機取鮮雞蛋50 枚，用水清洗后，置于鍋中加熱煮沸10 min，冷卻后剝除蛋殼和蛋白，將蛋黃置于潔凈磁盤中用玻璃棒搗碎后，于60 ℃烘箱中烘干至恒質量。用瓷研缽研碎后充分混勻，此為熟雞蛋黃樣品，保存于磨口瓶中，置于4 ℃冰箱中保存、備用。

1.3.3 VB2含量測定

稱取20 g（精確至0.000 1 g）熟雞蛋黃于250 mL錐形瓶中，加0.1 mol/L鹽酸70 mL，混勻，用瓷坩堝扣蓋瓶口，于10.3×104Pa壓力鍋水解30 min，冷卻后用1 moL/L氫氧化鈉溶液調pH值至 5.5，加3 mL 10 g/L木瓜蛋白酶溶液，39 ℃保溫酶解16 h，干濾紙過濾除雜后用pH 5.5的二次亞沸水定容至100 mL。取4 份10.00 mL過濾液分置于25 mL刻度比色管中，于第1份和第2份提取液中分別加1 μg/mL VB2標準溶液1.00 mL和2.00 mL；第4份加入低亞硫酸鈉0.50 mL，將VB2還原為無熒光物質作為背景空白，第3份不加標準溶液和低亞硫酸鈉，為原過濾定容試液。各管加水至15 mL后，加0.50 mL冰乙酸，加30 g/L高錳酸鉀溶液0.50 mL，混勻，放置2 min，氧化去雜質，滴加3.0 g/100 mL的雙氧水溶液至褪色，振搖使多余氧氣逸出后，加水定容至25 mL，在完全相同條件下進行3 次平行測定，檢驗無可疑值后取平均值，按式（1）計算樣品中VB2的含量。

式中：w為樣品中VB2含量/（μg/g）；ρ為標準溶液質量濃度/（μg/mL）；V標1、V標2分別為第1份、第2份過濾液中加入的標準溶液的體積/mL；I標1、I標2分別為第1份、第2份加標過濾液的相對熒光強度；I樣、I0分別為第3份、第4份過濾液的相對熒光強度；m樣為取樣質量/g；V樣1、V樣2分別為樣品過濾液定容總體積和測定時所用體積/mL。

2 結果與分析

2.1 波長的選擇

根據文獻[28]選擇最大激發波長和最大發射波長分別為440 nm和525 nm。

2.2 鹽酸體積的確定

稱取20.0 g（精確至0.000 1 g）雞蛋黃5 份分置于250 mL錐形瓶中，分別加入0.1 mol/L鹽酸50、60、70、80、90 mL，攪拌均勻后，按1.3.3節方法水解、酶解、過濾、氧化去雜質，定容至25 mL，平行測定3 次，取平均值，結果見圖1。

圖1 鹽酸體積對雞蛋黃樣品相對熒光強度的影響Fig. 1 Effect of hydrochloric acid volume on relative fl uorescence intensity

由圖1可知，加入0.1 mol/L鹽酸70 mL進行水解，雞蛋黃樣品相對熒光強度達到最大，為49.87。

2.3 酶解pH值的選擇

稱取20.0 g（精確至0.000 1 g）雞蛋黃于250 mL錐形瓶中，加入0.1 mol/L鹽酸70 mL，按照1.3.3節方法進行水解，水解液冷卻后，滴加1 moL/L氫氧化鈉溶液，分別調pH值為4.500、5.500、6.500、7.500、8.500。然后按照1.3.3節方法進行酶解和測定，平行測定3 次，取平均值，結果見圖2。

圖2 pH值對雞蛋黃樣品相對熒光強度的影響Fig. 2 Effect of pH on relative fl uorescence intensity

由圖2可知，酶解液pH 5.500時，測得的相對熒光強度最大，為49.97。實驗選擇pH 5.500為最佳酶解條件控制酸度。

2.4 低亞硫酸鈉溶液加入的體積

稱取20.0 g（精確至0.000 1 g）雞蛋黃于250 mL錐形瓶中，按1.3節操作定容至100 mL后，分別置于6 個25 mL的比色管中加10.00 mL雞蛋黃過濾液，按1.3.3節方法氧化去除雜質，分別加入0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL和0.60 mL 20 g/100 mL低亞硫酸鈉溶液，定容至25 mL，混勻后，平行測定3 次，取平均值，測定結果如圖3所示。

圖3 低亞硫酸鈉體積對雞蛋黃樣品相對熒光強度的影響Fig. 3 Effect of Na2S2O4 volume on relative fl uorescence intensity

由圖3可知，10.00 mL雞蛋黃過濾液加入0.50 mL低亞硫酸鈉較為合適。

2.5 VB2標準溶液體積的確定

稱取20.0 g（精確至0.000 1 g）雞蛋黃于250 mL錐形瓶中，按1.3.3節水解、酶解、過濾、定容后，分別置于8個25 mL試管中各加10.00 mL過濾液，在3、4、5、6、7、8號管中分別加入1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL和6.00 mL 1 μg/mL VB2標準使用液，1號和2號管不加標準溶液，以下按照1.3.3節方法操作，定容至25 mL混勻，各管平行測定3 次，取平均值，代入公式計算雞蛋黃VB2含量然后和GB/T 5009.85—2016《食品中核黃素的測定》[28]測定結果對照，如表1所示。

表1 雞蛋黃中VB2含量Table 1 Selection of optimal standard solution volumes added to analyte samples

由表1可知，加標1.00、2.00 mL測得含量和國標法結果最接近，因此，本實驗選擇1 μg/mL VB2標準使用液添加量1.00、2.00 mL為最佳差異加標體積。

2.6 加標回收率

稱取20.0 g（精確至0.000 1 g）雞蛋黃，按照1.3.3節方法操作，用1 μg/mL VB2進行加標回收率實驗，各加標質量濃度分別進行3 次平行測定，由表2可知，樣品的加標回收率為92.0%～104%。

表2 加標回收率Table 2 Analyte recoveries from spiked yolk

2.7 檢出限和定量限

取0.1 μg/mL VB2標準溶液進行11 次平行測定，計算出標準偏差，按3 倍標準偏差得VB2檢出限為5.76×10-3μg/mL，按10 倍標準偏差計算的定量限為1.92×10-2μg/mL。

2.8 測定結果對照

按1.3.3節方法和國標法[28]第一法對照分析，各進行6 次平行測定，檢驗無可疑值后，取平均值，結果如表3所示。

由表3可知，平行測定的相對標準偏差不大于1.5%；2 種方法按文獻[31]進行F檢驗和t檢驗，結果表明：置信度為95%時，分子熒光差異加標法和國標法的精密度、平均值皆不存在顯著性差異。

表3 分子熒光加標法和國標法測定雞蛋黃中VB2結果Table 3 Comparison of VB2contents in yolk determined by the developed method and the fi rst method described in the national standard

3 結 論

利用差異加標新技術在最佳條件下測定雞蛋黃樣品中VB2含量為402 μg/100 g，相對標準偏差為1.0%（n=6），加標回收率為92.0%～104%，檢出限為5.76×10-3μg/mL，定量限為1.92×10-2μg/mL。該法與國標法對照測定，樣品測定結果經過F檢驗和t檢驗表明：2 種方法間的精密度和平均值均不存在顯著性差異。該方法只需用2個加標質量濃度不同的試液，在條件完全相同下測定同體積試液的發光信號，即可按公式快速獲得測定結果，無需繪制工作曲線和過柱去雜質。差異加標法扣除了樣品試液中背景發光值以及質量濃度差異所可能帶來的干擾，克服了標準曲線法的諸多缺點，實現了待測試液與標準溶液的同步實時測定，提高了測定準確度和工作效率，簡便、快速，是適合蛋黃等較為復雜生物樣品中VB2測定的新型分析技術，該技術不但適用于分子熒光分析，也適用于分子磷光、化學發光、生物發光和原子熒光、原子發射光譜等其他定量分析發光體系，有較強的創新性、實用性和推廣應用價值。

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Rapid Determination of Vitamin B2in Egg Yolks by Molecular Fluorescence Differential Standard Addition Method

GAO Xiangyang, ZHANG Na, GUO Nannan, YUE Xiju, WEI Long
(Department of Food Science and Engineering, Zhengzhou University of Science and Technology, Zhengzhou 450064, China)

This study aimed to establish a new rapid and simple method for the quantitative determination of riboflavin in biological samples, namely molecular fl uorescence differential standard addition method. The results showed that the ribofl avin content in yolks determined by the method was 402 μg/100 g with relative standard deviation (RSD) of less than or equal to 1.5% (n = 6). The recoveries of the analyte from spiked samples ranged between 92.0% and 104%. The limit of detection (LOD) of the method was 5.76 × 10-3μg/mL and the limit of quantitation (LOQ) was 1.92 × 10-2μg/mL. This method was tested under the same conditions without background interference and without the need to prepare a working curve and to remove impurities by column chromatography. It was rapid, accurate, simple, practical and suitable for the determination of vitamin B2in egg yolks.

molecular fl uorescence; differential standard addition method; egg yolks; vitamin B2

O657.3

A

1002-6630（2017）20-0318-04

高向陽, 張娜, 郭楠楠, 等. 分子熒光差異加標法快速測定蛋黃中VB2的含量[J]. 食品科學, 2017, 38(20)∶ 318-321.DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720047. http∶//www.spkx.net.cn

GAO Xiangyang, ZHANG Na, GUO Nannan, et al. Rapid determination of vitamin B2in egg yolks by molecular fluorescence differential standard addition method[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 318-321. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720047. http∶//www.spkx.net.cn

2017-01-13

鄭州市科技局新興產業研究與開發基金資助項目（153PXXCY186）

高向陽（1949—），男，教授，學士，研究方向為食品安全快速分析與檢驗。E-mail：ndgaoxy@163.com

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720047