上饒市乙型流感病毒耐藥基因分析

張艷燕， 賴 宇， 朱 琳， 熊 英， 李健雄， 程暢河

上饒市乙型流感病毒耐藥基因分析

張艷燕1， 賴 宇2， 朱 琳1， 熊 英3， 李健雄3， 程暢河2

目的分析上饒市乙型流感病毒耐藥基因，為臨床用藥和疾病控制提供依據。方法從哨點醫院采集疑似流感患者咽拭子樣本，接種犬腎傳代細胞（Madin-Darby Canine Kidney，MDCK）及進行分離培養。選擇分離到的乙型（即B型）流感病毒株進行核酸提取后進行反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR），擴增神經氨酸酶（neuraminidase，NA）基因并進行核苷酸測序，采用DNA Star6.0、Mage5.0生物軟件對測序結果進行分析處理，推導出氨基酸序列，進行基因特性分析。結果7 株乙型流感病毒NA基因同源性高達99.5%以上，NA蛋白催化活性位點和輔助位點均無氨基酸替換。結論7株毒株均對流感病毒NA抑制劑藥物敏感，但仍應加強對流感病毒的耐藥性監測。

乙型流感病毒； 耐藥； 神經氨酸酶基因

Abstract: ObjectiveTo characterize the neuraminidase (NA) genes of in fluenza B virus in Shangrao.MethodsThe specimens of nasopharyngeal swabs were collected from patients with in fluenza-like symptoms in in fluenza sentinel hospital. Seven strains of in fluenza B virus were randomly selected for culture and isolation in Madin-Darby Canine Kidney Epithelial Cells (MDCK Line).Viral RNA was extracted. Fragments of NA genes were ampli fied by one-step RT-PCR and then were sequenced. The data obtained were analyzed with software DNAStar 6.0 and Mage 5.0. The deduced amino acid sequences were examined to explore the features of NA gene.ResultsThe NA gene showed high homology of nucleotides between the 7 strains of in fluenza B virus. No amino acid substitution was found in catalytic or framework residues of the deduced amino acid sequences of NA gene.ConclusionsAll the 7 strains of in fluenza B virus were sensitive to neuraminidase inhibitors. However, ongoing resistance surveillance is necessary for control and prevention of in fluenza.

Key words:in fluenza B virus; resistance; neuraminidase gene

流感病毒分為甲型、乙型和丙型3類，以甲型和乙型流感病毒最為常見。其中乙型即B型流感病毒是感染人類的主要病原體之一，雖然對人類致病性較低，呈暴發和小流行，不引起世界性流感大流行，但在某些特定情況下造成危害不應忽視[1]。其臨床主要治療藥物為神經氨酸酶抑制劑（NAI），隨著長時間的使用該類藥物，耐藥毒株也隨之出現并引起重視。本研究分析江西省上饒市乙型流感病毒神經氨酸酶（NA）基因特征，從而分析了我市乙型流感病毒的耐藥性，為臨床用藥和疾病控制提供依據。

1 材料與方法

1.1 標本選擇

從上饒市人民醫院采集的疑似流感患者咽拭子樣本接種于犬腎傳代細胞（Madin-Darby Canine Kedney，MDCK），細胞進行病毒分離，采用血凝試驗（HA）和血凝抑制試驗（HI）鑒定出陽性毒株，按照樣本采集的時間分層抽樣隨機選取7株乙型流感病毒毒株（所有毒株均經國家流感中心復核鑒定）。

1.2 方法

1.2.1病毒核酸提取和擴增 用德國Qiagen 公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit 試劑提取以上選取的7株乙型流感病毒毒株的RNA；采用QIAGEN One Step RT-PCR Kit 試劑盒并加入引物（NA-5’[2]上引物 GCAGAAGCAGAGCATATTCTTAG，下引物 ATGGACAAATCCTCCCTTGATGC ；NA-3’[3]上引物 GCACTCCTAATTAGCCCTCATAGA，下引物 AGGACAATTGTTCAAAC）進行反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）（基因擴增反應條件[4]：60 ℃，1 min ；42 ℃，10 min ；50 ℃，30 mim ；95 ℃，15 min。PCR 循 環 如 下 ：94 ℃，40 s；50 ℃，40 s； 72 ℃，1 min，30 s；35次 循 環，72 ℃，10 min.）。

1.2.2核苷酸序列測定 PCR產物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行雙向測定。

1.2.3序列分析 采用DNAStar6.0、Mage5.0序列分析軟件[5]對測序后核苷酸進行分析，以B/Beijing/1/1987（國家流感中心指定）的NA基因序列作為參比分析，序列收錄號為M54967[4]。

2 結果

2.1 基因遺傳進化分析

選取的7株上饒市乙型流感病毒均為Yamagata系，其編號分別為：B/j i a n g x i x i n z h o u/1 1 9/2 0 1 4、B/j i a n g x i x i n z h o u/1 1 4 1/2 0 1 4、B/ j i a n g x i x i n z h o u/1 1 6 6/2 0 1 4、B/ j i a n g x i x i n z h o u/1 2 1 7/2 0 1 4、B/ j i a n g x i x i n z h o u/1 2 3 9/2 0 1 4、B/ j i a n g x i x i n z h o u/1 2 5 2/2 0 1 4、B/ j i a n g x i x i n z h o u/1 3 3 2/2 0 1 4。

在NA基因氨基酸序列的種系進化樹（圖1）上可見7株毒株與B/beijing/1/1987比較均在同一個分支上，其中B/jiangxixinzhou/1166/2014與其他6株有略微差異，因此存在一個小的分支。

2.2 基因核苷酸和氨基酸同源性

經生物軟件分析，與B/Beijing/1/1987的序列進行比較，核苷酸同源在93.4%～93.7%，氨基酸同源性均為92.5%，而這7株病毒之間NA基因核苷酸序列的同源性為99.5%～100%；氨基酸序列的同源性達到99.4%～100%（表1和表2）。

圖1 上饒市乙型流感病毒NA基因進化樹Figure 1 Phylogenetic tree for 7 strains of in fl uenza B virus detected in Shangrao in terms of neuraminidase gene

表1 7株乙型流感病毒NA基因核苷酸的同源性分析Table 1 Nucleotide homology of NA gene between 7 strains of in fl uenzaBvirus（%）

2.3 NA基因耐藥性位點分析

根據核苷酸序列推導出NA基因氨基酸序列前500位，其中對NA基因酶催化活性位點（B Numbering）（R-116、D-149、R-150、R-223、E-275、R-292、 R374和406）氨基酸和輔助位點（E-117、R-154、W-177、S-178、D-197、I-221、E-226、H-273、E-276和N-294，E428位）氨基酸7株毒株均未發生替換，說明當前情況下NA基因耐藥性未發生變化。

3 討論

乙型流感病毒變異進化的主要機制是基因片段重配和堿基的插入或缺失，這既可以發生在Victoria系和Yamagata系之間，也可發生在同一系別不同分支的病毒之間[6]。雖然乙型流感病毒Victoria系和Yamagata系進化特點不盡相同，但它們具有在人群中共存、共同進化的特征[7]。流感病毒NA是流感病毒重要的表面糖蛋白，具有抗原性，可以催化唾液酸水解，協助成熟流感病毒脫離宿主細胞感染新的細胞[8]。NA通過抗原性轉變可以改變病毒的毒力和耐藥性，當病毒發生變異從而使它們更有利于生存或更有利于逃避宿主免疫應答時，新毒株會代替老毒株，導致病毒進化[6]。本實驗通過對7株乙型流感病毒NA基因的測序分析，從進化樹、核苷酸和氨基酸的同源性等3方面比較，均表明7株毒株與標準株B/beijing/1/1987之間的差距很小，在進化樹上處于同一分支上；核苷酸和氨基酸的同源性均在90%以上；從氨基酸序列上看，影響耐藥的基因位點均未發生改變；說明當前乙型流感病毒NA基因仍未發生變異。

表2 7株乙型流感病毒NA基因氨基酸序列的同源性分析Table 2 Homology of the deduced amino acid sequence of NA gene between 7 strains of in fl uenza B virus（%）

臨床上治療乙型流感的藥物僅有依賴NAI，流感病毒NA被作為藥物靶點[9]。全基因組分析證明影響病毒耐藥性的主要是NA基因酶催化活性 位 點（B Numbering）（R-116、D-149、R-150、R-223、E-275、R-292、 R374和 406）氨基酸和輔助 位 點（E-117、R-154、W-177、S-178、D-197、I-221、E-226、H-273、E-276和N-294，E428位）氨基酸[7，10]。本實驗結果發現這些影響耐藥性的位點均未發生改變，表明流感病毒對NAI藥物敏感。這也和熊英等[4]報道的江西省內2009－2012年乙型流感病毒耐藥基因分析相一致，說明在本地區范圍內迄今為止尚未出現乙型流感病毒耐藥現象。另外，有報道NA基因在198、222、250、402等位點基因突變可以降低NAI的靈敏度[11]。本次實驗亦發現除B/jiangxixinzhou/1166/2014外其他6株毒株基因在氨基酸402位都發生了A402T的替換，這些替換點位說明乙型流感病毒的變異可能已經影響了NAI的靈敏度，但具體對臨床使用藥物的影響，尤其耐藥性的影響，仍有待進一步的研究。

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Neuraminidase gene pro filing of in fluenza Bvirus in Shangrao

ZHANG Yanyan, LAI Yu, ZHU Lin, XIONG Ying, LI Jianxiong, CHENG Changhe. （Department of Laboratory Medicine, Shangrao Center for Disease Control and Prevention, Shangrao Jiangxi 334000, China）

R373.13

A

1009-7708 ( 2017 ) 05-0538-03

10.16718/j.1009-7708.2017.05.010

2017-01-03

2017-02-27

2014年江西省醫學學科省市共建計劃項目（201412）。

1. 上饒市疾病預防控制中心檢驗科，江西上饒 334000；

2. 江西醫學高等專科學校藥學系；

3. 江西省疾病預防控制中心檢驗科。

張艷燕（1984—），女，本科，主管技師，主要從事病毒的檢測工作。

程暢河，E-mail：chengchanghe@hotmail.com。