基因芯片法在肺結核診斷中的臨床應用價值

陳蕾

基因芯片法在肺結核診斷中的臨床應用價值

陳蕾

目的探討基因芯片技術在肺結核診斷中的應用價值。方法采集641例肺結核患者的痰及纖支鏡沖洗液標本，同時進行抗酸染色法、MGIT液體培養法+微孔板比例法藥物敏感性試驗((簡稱“藥敏試驗”)及基因芯片法檢測，分析不同方法檢測結核分枝桿菌(Mtb)及其異煙肼、利福平耐藥性的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和kappa值。不同方法之間Mtb及耐異煙肼、耐利福平、耐多藥陽性檢出率的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。結果基因芯片法敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和kappa值均較高。基因芯片法Mtb陽性檢出率54.91%高于涂片法27.61%，與液體培養法60.06%比較差異無統計學意義。基因芯片法和藥敏試驗檢測Mtb耐異煙肼、耐利福平、耐多藥陽性檢出率，兩者比較差異無統計學意義。結論基因芯片法在檢測Mtb及其耐藥性方面與傳統液體培養法和藥敏試驗相比，有較高的敏感度和特異度，檢測時間短，一致性高，值得臨床應用推廣。

基因芯片技術；肺；結核分枝桿菌；診斷

資料與方法

一、標本來源

采集2015年11月至2016年11月住院肺結核患者痰及纖支鏡沖洗液標本，排除檢測失敗、污染等因素，實際納入標本共計641例，其中有痰者取痰液536例，無痰者行纖維支氣管鏡檢查取纖支鏡沖洗液105例。對標本同時進行抗酸染色鏡檢、液體MGIT培養+藥敏試驗和基因芯片檢測。

二、研究方法

1. 涂片檢查:采用萋-尼氏染色法，并遵照《痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》[3]的要求進行操作。

2. 液體培養檢查:采用BACTEC MGIT960培養基，按照《分枝桿菌分離培養標準化操作程序及質量保證手冊》[4]的要求進行培養，所有涂片標本均進行培養檢查。

3.藥敏試驗：經BACTEC MGIT960快速培養后分離的陽性菌株，采用微孔板比例法，按照《結核分枝桿菌藥物敏感性試驗標準化操作程序及質量保證手冊》[5]的要求進行藥敏試驗。

4.基因芯片法：利用儀器對患者標本經過標本處理-核酸提取-PCR擴增-雜交反應-芯片掃描-自動判讀，發現突變的耐藥基因。根據Mtb的耐藥性與基因突變有關的分子機制，通過檢測位點的突變情況判斷耐藥性，如利福平耐藥相關基因ropB、異煙肼耐藥相關基因KatG、inhA。如果耐藥相關基因為野生型，判斷為相應藥物敏感，如耐藥相關基因為突變型，判斷為相應藥物耐藥。

5.試劑與儀器

試劑：試驗所用染色液、藥敏試驗用培養基均由珠海貝索生物技術有限公司提供。基因芯片法試劑包括晶芯分枝桿菌核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)、晶芯分枝桿菌菌種鑒定試劑盒、晶芯Mtb耐藥基因檢測試劑盒(DNA微陣列芯片法)、核酸提取液、PCR擴增試劑、雜交緩沖液、配套基因芯片等購自北京博奧生物有限公司

儀器：晶芯ExtractTM核酸快速提取儀、CapitalBio基因芯片雜交盒、BioMixerTM芯片雜交儀、AB1 7500PCR擴增儀、Slide-WasherTM芯片洗干儀、LuxScanTM10K-B微陣列芯片掃描儀等均購自北京博奧生物有限公司。

6.統計學分析：應用SPSS13.0軟件進行統計學分析。以液體培養法為金標準，計算涂片法、基因芯片法檢測Mtb的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值。以藥敏試驗為金標準，計算基因芯片法檢測異煙肼、利福平耐藥性的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值。不同方法檢測結果的一致性用kappa檢驗判別(kappa≥0.75具有高度一致性，0.75>kappa≥0.4具有較好一致性，kappa<0.4具有較差一致性)。不同方法之間Mtb及異煙肼、利福平、耐多藥陽性檢出率的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、 采用涂片法、培養法、基因芯片法檢測分枝桿菌結果

641例標本(痰536例，纖支鏡沖洗液105例)同時采用三種方法檢測Mtb，以液體培養法檢測結果為金標準，基因芯片法檢測技術的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為86.23%(332/385)、92.19%(236/256)、94.32%(332/352)、81.66%(236/289)，kappa檢驗，K=0.77,兩者具有高度的一致性；抗酸染色涂片法檢測技術的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為45.71%(176/385)、99.61%(255/256)、99.44%(176/177)、54.96%(255/464)，kappa檢驗，K=0.40,兩者具有較好的一致性(見表1)。

二、 采用藥敏試驗、基因芯片法檢測Mtb異煙肼、利福平耐藥性結果

641例標本通過培養共獲得385例陽性Mtb菌株。排除耐藥檢測失敗等因素，可比對的332例Mtb(痰257例，纖支鏡沖洗液75例)以藥敏試驗檢測異煙肼、利福平耐藥結果為金標準，基因芯片法檢測異煙肼、利福平耐藥的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為75.41%(46/61)、99.63%(270/271)、97.87%(46/47)、94.74%(270/285)和79.17%(38/48)、97.54%(277/284)、84.44%(38/45)、96.52%(277/287)。kappa檢驗兩者分別為K值0.82及0.79,兩者具有高度的一致性(見表2)。

三種檢測方法Mtb陽性檢出率比較：641例標本同時采用抗酸染色法、液體培養法、基因芯片法檢測Mtb，總體陽性檢出率分別為27.61%(177/641)、60.06%(385/641)、54.91%(352/641)。基因芯片法陽性率高于抗酸染色法，兩者比較差異有統計學意義(χ2=98.56，P<0.05)；低于液體培養法，但兩者比較差異無統計學意義(χ2=3.47，P>0.05)。抗酸染色法陽性率低于液體培養法，兩者比較差異有統計學意義(χ2=137.13，P<0.05)。

表1 涂片法、培養法、基因芯片法檢測Mtb結果

表2 藥敏試驗、基因芯片法檢測Mtb異煙肼、利福平耐藥性結果

不同標本類型比較Mtb陽性檢出率:痰標本基因芯片法低于液體培養法，兩者比較差異有統計學意義(χ2=10.19，P<0.05)。纖支鏡沖洗液標本基因芯片法高于液體培養法，兩者比較差異無統計學意義(χ2=1.75，P<0.05)(見表3)。

表3 三種檢測方法Mtb陽性檢出率比較

三、 兩種檢測方法Mtb耐異煙肼、耐利福平、耐多藥陽性檢出率比較

比對分析藥敏法和基因芯片法檢測332例Mtb的耐藥性，異煙肼耐藥率分別為18.37%(61/332)和14.16%(47/332)，兩者間差異無統計學意義(χ2=2.17,P>0.05)。利福平耐藥率分別為14.46%(48/332)和13.55%(45/332)，兩者間差異無統計學意義(χ2=0.11,P>0.05)。耐多藥率分別為13.25%(44/332)和11.14%(37/332)，兩者間差異無統計學意義(χ2=0.69,P>0.05)(見表4)。

討 論

基因芯片技術在檢測Mtb及耐藥性的臨床應用越來越廣泛，其結合了分子生物學高靈敏度和生物芯片的高通量性具有快速、靈敏、準確等特點[6]。目前國內外多家機構研究報道顯示，應用基因芯片技術檢測Mtb及其耐藥性方面靈敏度、特異度各家不一。本研究利用基因芯片技術檢測我院住院病人641例標本的Mtb及耐藥性，通過與傳統方法相比較，探討其在肺結核病診斷方面的應用價值。

表4 兩種檢測方法耐藥Mtb陽性檢出率比較

一 、Mtb檢測

以液體培養法為金標準，與抗酸染色法相比，基因芯片法敏感度(82.23%)顯著高于抗酸染色法(45.71%)，特異度(92.19%)與抗酸染色法(99.61%)相似，一致性達0.77，顯著高于涂片法(K=0.40)。提示檢測Mtb該方法優于抗酸染色法且可靠性佳。本研究中基因芯片法敏感度特異度與董永康等報道的敏感度92.3%特異度100%略有差異[7]。這可能一方面與選擇的金標準不同有關，本實驗以MGIT液體培養法作為金標準，液體培養法耗時長但自我繁殖能力強檢測敏感度相對最高；另一方面與標本質量有關，本研究中的53例基因芯片未檢測出的Mtb均為痰標本，提示痰標本的質量、細菌數量可能低于纖支鏡沖洗液，降低檢測敏感度。20例培養陰性基因芯片陽性的標本分析，液體培養法漏檢主要與實驗人員的操作(如配制的菌懸液偏低，過早判讀菌落生長結果等)和受試菌株的生長狀態等因素有關。傳統液體培陽法操作繁瑣、費時，影響因素多，生物安全防護要求高，在基層實驗室不易實施，本研究印證了基因芯片法靈敏度特異度較高且快速可靠，對臨床快速診斷有十分重要的意義[8]。

二、耐藥性檢測

以藥敏試驗為標準，基因芯片法檢出Mtb耐利福平敏感度79.17%、特異度97.54%、K值0.79，耐異煙肼敏感度75.41%、特異度99.63%、K值0.82，敏感度略低于李曉菲等的報道[9]。上述結果的差異一方面可能與后者所研究的涂陽標本增加耐藥表型敏感度有關。另一方面本研究中異煙肼15例、利福平10例耐藥表型陽性與基因型不一致,分析可能與分枝桿菌菌種差異、混合感染等因素有關，此類耐藥表型與基因型不一致現象國外亦有報道，在臨床僅為少數，不影響該技術臨床應用價值[10]。值得注意的是本研究中利福平7例耐藥基因型陽性與表型不一致，分析可能與低濃度耐藥突變導致耐藥表型無法檢測出有關[11]。總體來說基因芯片的敏感度特異度均較高，尤其耐異煙肼和耐利福平檢測特異度極佳，且均具有極好的一致性(K值均大于0.75)，提示該方法能夠快速準確檢測Mtb對異煙肼和利福平的耐藥性，在結核病的快速診療領域具有廣闊的應用前景。

三、 Mtb 及耐藥性陽性檢出率

本實驗同時采用抗酸染色、液體培養及基因芯片法檢測Mtb，液體培養法檢測陽性率(60.06%)最高，其次為基因檢測法(54.91%)，抗酸染色法(27.61%)最低。基因芯片法檢測Mtb陽性率高于抗酸染色法，兩者比較差異有統計學意義；低于液體培養法，但兩者比較差異無統計學意義。提示在檢測Mtb方法準確性上基因芯片法優于傳統涂片法，在快速性上優于液體培養法。比對分析藥敏法和基因芯片法檢測Mtb的耐異煙肼、耐利福平、耐多藥陽性檢出率，兩者間差異均無統計學意義。提示相對于傳統抗酸染色、培養技術而言，基因芯片法不但提高了Mtb檢測的敏感度和穩定性，而且在耐藥性檢測效能上接近藥敏法且快速性上更具優勢。

四、不同標本類型Mtb及耐藥性陽性檢出率

不同標本類型間Mtb陽性檢出率比較，僅基因芯片法陽性率痰標本50%與纖支鏡沖洗液標本70.48%比較差異有統計學意義(χ2=14.79，P<0.05)，其余涂片法27.43%與28.57%比較(χ2=0.06，P>0.05)、液體培養法59.70%與61.90%比較(χ2=0.0.18，P>0.05)差異均無統計學意義。不同標本類型間耐藥Mtb陽性檢出率比較，無論基因芯片法還是藥敏法檢測均高度一致。提示一方面支氣管沖洗液可根據纖支鏡鏡下所見直接取材病變部位，避免口咽部細菌污染，同時沖洗作用疏通引流支氣管并引出遠端病灶的Mtb，回收細菌多，故基因芯片Mtb陽性檢出率更高，另一方面纖支鏡沖洗液標本量相對較少，需在今后工作中加大樣本量進一步分析評估。

總之，基因芯片法檢測痰液及纖支鏡沖洗液中Mtb具有較高的敏感性和特異性，一致性好，操作簡單，自動化程度高，生物危害度小，雖然檢測Mtb方面與選用參考標準、標本類型存在一定差異，分析耐藥范圍較狹窄，技術成本昂貴，但其6小時就可檢測異煙肼、利福平耐藥性的特點，相對于需要漫長等待的培養和藥敏試驗結果來說，對于臨床快速準確診斷和治療結核病具有更加重要的意義，值得臨床推廣應用。

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[5] 趙雁林，王黎霞，成詩明，等.結核分枝桿菌藥物敏感性試驗標準化操作程序及質量保證手冊[M].北京：人民衛生出版社，2013：15-28.

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Genechipindiagnosisofpulmonarytuberculosisanditsclinicalapplicationvalue

CHENLei

PublicHealthyClinicalMedicalCenterofChengdu,Chengdu,Sichuan610000,China

ObjectiveTo explore the application value of gene chip technology in diagnosis of pulmonary tuberculosis.MethodsThe data of 641 cases of pulmonary tuberculosis patients with sputum and bronchoscopic lavage specimens were detected by acid fast stain, MGIT liquid ((hereinafter referred to as "drug sensitive test") detection and gene chip method. Their drug sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value and Kappa value of Mycobacterium tuberculosis (Mtb), isoniazid and rifampicin were analyzed, and the results were analyzed by X2 test among different groups.P<0.05 difference was statistically significant.ResultsThe sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value and Kappa value were higher for gene chip method. The positive rate of Mtb was 54.91% in the gene chip group, which was higher than 27.61% of the smear method group (P<0.05) and similar with 60.06% of the liquid culture method group. There was no significant difference in the positive rate of isoniazid, rifampin and multi-drug resistance of Mtb between the gene chip group and the drug sensitive test group.ConclusionGene chip method has high sensitivity and specificity and consistency in detection of Mtb and its drug resistance, which is worthy of widely clinical application.

gene chip technique; pulmonary; Mycobacterium tuberculosis; diagnosis

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.010.038

610000 四川 成都，成都市公共衛生臨床醫療中心(凈居寺院區)

結核病的病原學診斷，目前臨床上還是主要依賴于傳統的涂片法和培養法。涂片法敏感度較低，特異度較差；作為金標準的液體培養法加藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)方法耗時長，需要4-8周才能獲得結果，且程序繁瑣，重復性差，對結核病尤其是耐藥結核病的早期診斷治療帶來了障礙[1]。因此，臨床迫切需要一種新型、快速、準確的檢測方法，快速完成結核分枝桿菌(Mtb)檢測及耐藥性分析，為臨床治療爭取時間。近年來應用分子生物學診斷技術檢測Mtb成為傳統診斷方法的重要補充，也是結核病快速診斷主要的研究方向[2]。基因芯片技術是一種新型核酸檢測方法，可快速檢測結核分枝桿菌耐利福平和異煙肼3個基因(ropB、KatG、inhA)的常見突變位點，并鑒定非結核分枝桿菌屬。本研究將基因芯片法與傳統痰涂片檢查、液體培養法做比較，對該技術檢測痰和纖支鏡沖洗液標本中結核分枝桿菌的效果和臨床價值進行評價。

2017-02-04 ]