邢臺地區275株結核分枝桿菌VNTR基因分型及表型耐藥研究

張志 李雅楠 高會霞 許怡 戴二黑

邢臺地區275株結核分枝桿菌VNTR基因分型及表型耐藥研究

張志 李雅楠 高會霞 許怡 戴二黑

目的初步了解邢臺地區結核分枝桿菌臨床分離株的基因型多態性及表型耐藥特征，探討各基因型與表型耐藥之間的相關性。方法收集2014年1月至2014年10月期間在邢臺市傳染病醫院就診的結核病患者經臨床分離培養得到的結核分枝桿菌菌株及相應病例背景資料，采用15位點數目可變串聯重復序列分析(VNTR)進行基因分型研究，采用比例法進行一線抗結核藥的藥物敏感性試驗。運用BioNumerics 5.0軟件進行聚類分析，運用SPSS16.0軟件進行數據分析。結果該地區的總耐藥率為31.6%，初始耐藥率為24.2%，獲得性耐藥率為56.3%。復治患者的耐藥率顯著高于初治患者耐藥率。275株結核分枝桿菌可分為145種VNTR基因型，其中165株菌被聚類為35個簇，110株菌的基因型為獨特基因型。VNTR對所有菌株的HGDI值為0.9838。成簇型菌株與獨特型菌株在患者年齡、性別、職業、地勢、治療史、吸煙史、糖尿病史等的分布差異無統計學意義。成簇型菌株與獨特型菌株的單耐藥水平和耐多藥水平也無統計學差異。結論邢臺地區的結核分枝桿菌臨床分離株呈現明顯的基因多態性。本研究尚未發現VNTR基因分型與表型耐藥的相關性。

結核分枝桿菌；基因分型；多位點數目可變串聯重復序列

結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的呼吸道傳染性疾病。隨著京津冀一體化加速，人口流動性增加，艾滋病廣泛傳播，結核病疫情不斷加劇。分子流行病學研究能夠從病原分子水平監測傳染病的暴發、追蹤傳染源并揭示感染傳播機制。但是，目前尚無邢臺地區結核分枝桿菌分子流行病學研究的報道。本研究擬通過數目可變串聯重復序列分析(VNTR)對邢臺地區MTB臨床分離株進行基因分型研究，以初步了解該地區MTB的基因分型特征，并采用比例法進行一線抗結核藥物敏感試驗，探討各基因型與表型耐藥之間的相關性。

資料與方法

一、菌株來源

在2014年1月至2014年10月共收集到結核分枝桿菌臨床分離株275株。所有菌株均在邢臺市傳染病醫院就診的結核病患者的痰標本，經臨床分離培養獲得，并經PNB/TCH鑒別培養基鑒定的結核分枝桿菌臨床分離株，-80℃保存。結核分枝桿菌標準株H37Rv由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所結核病室提供。

二、病例信息

男性患者181例，女性患者94例。初治211例，復治64例。93名患者有吸煙史，36名患者合并糖尿病。患者以農民、學生、工人為主，其中農民有151例，占總數的54.9%。

三、主要試劑

異煙肼、利福平、乙胺丁醇和鏈霉素含藥培養基，購自武漢貝索生物技術有限公司。DNA提取試劑盒購自美國Qiagen公司，2×Taq MasterMix購自北京康為世紀生物科技有限公司。PCR引物由北京天一輝遠生物公司合成。

四、藥敏試驗

采用比例法藥敏試驗，按照《結核分枝桿菌藥物敏感性實驗標準化操作程序及質量保證手冊》的固體培養標準化操作步驟進行[1]。取適量菌懸液采用濃度梯度稀釋法制備濃度分別為10-2mg/mL和10-4mg/mL的菌懸液，分別接種于4種含藥培養基(異煙肼、利福平、鏈霉素和乙胺丁醇)和陰性對照培養基斜面上，每批實驗以H37Rv標準菌株作為陽性對照。接種后的培養基放于37℃培養，每周觀察一次，28后記錄結果。耐藥百分比=(含藥培養基的菌落數/陰性對照培養基的菌落數)×100%。若耐藥百分比>1%，認為該菌對該抗結核藥耐藥；若耐藥百分比≤1%，認為是敏感菌。

五、DNA提取

將菌落從羅氏培養基上刮下，置于200μL 細菌裂解液中，置于渦流機充分震蕩。金屬浴100℃，10min后拿出，置于室溫2min。13,000g離心5min。取上清液移至1.5mL離心管中。-20℃保存備用。

六、VNTR檢測

1 采用15位點VNTR對菌株進行基因分型研究[2-3]。采用Hunter-Gaston分辨指數(Hunter- Gaston discriminatory Index，HGDI)來評價各位點對菌株的分辨能力，即等位基因多態性。采用成簇率評價該地區菌株的近期傳播情況。計算公式：

(其中N代表菌株總數，s代表總的基因型數，nj代表屬于j基因型的菌株數)

2 PCR反應體系(20μL)：上、下游引物(10μM)各1μL，DNA模板1μL，2×Taq Master Mix 10μL，ddH2O 7μL；陽性對照為結核分枝桿菌H37Rv，陰性對照為ddH2O。

3 PCR反應條件：94℃ 5min(預變性)，94℃ 30s(變性)，60℃ 30s(退火)，72℃ 45s(延伸)，35個循環；72℃ 10min(充分延伸)。

4 檢測和分析：配置濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠(其中加入0.4μg/mL的DNA染料GoldView),上樣量為3 μL，電泳電壓采用10 V/cm，當指示劑距下一排上樣孔2cm時，停止電泳。采用BIO-RAD凝膠成像儀進行凝膠成像，以標準菌株H37Rv作為對照，用100 bp DNA Marker來確定相對分子質量的大小，將指紋圖譜數字化，再用BioNumerics 5.0軟件(Applied Maths，比利時)進行聚類分析。

七、統計分析

計數資料之間的比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率檢驗。所有假設檢驗均為雙側檢驗，P值小于0.05時，認為差異有統計學意義。

結 果

一、藥敏結果

188株MTB菌株對四種一線抗結核藥(異煙肼、利福平、鏈霉素和乙胺丁醇)均敏感，87株至少對一種藥物耐藥。其中，17株單耐鏈霉素，6株單耐異煙肼，3株單耐利福平，1株單耐乙胺丁醇，3株對鏈霉素和異煙肼同時耐藥，5株對異煙肼和利福平同時耐藥，3株對鏈霉素和利福平同時耐藥，1株對鏈霉素和乙胺丁醇同時耐藥，20株對鏈霉素、異煙肼和利福平同時耐藥，5株對異煙肼、利福平和乙胺丁醇同時耐藥，23株對四種藥均耐藥。耐兩種以上藥物的菌株有60株，占所有菌株的21.8%，占耐藥株的69.0%。復治患者的耐藥率為56.3%(36/64)，初治患者的耐藥率為24.2%(51/211)，復治患者的耐藥率顯著高于初治患者的耐藥率，差異有統計學意義(P<0.0001)。此外，分析了敏感菌株和耐藥菌株與患者背景資料之間的相關性，結果顯示，敏感菌株和耐藥菌株在患者年齡、性別、職業、生活地勢、吸煙史、糖尿病史以及治療史等方面的分布無統計學差異，(見表1)。

二、數目可變串聯重復序列分析

本研究選取了15個VNTR基因位點對275株結核分枝桿菌臨床分離株進行基因分型，結果顯示不同菌株的DNA指紋圖譜在某些位點呈現多態性，在某些位點呈現一致性，聚類分析結果(見圖1)。經BioNumerics軟件聚類分析，275株結核分枝桿菌呈現145種基因型，其中110株菌為單一菌株類型，呈現獨特的基因型，占所有菌株的40.0%；165株菌可被聚類為35個簇，占所有菌株的60.0%。最大的一簇包含28株(10.18%)菌株，在15個VNTR位點的擴增片段拷貝數依次為：4 2 4 3 5 3 3 5 7 3 3 3 5 4 4。成簇型和獨特型在患者的年齡、職業、地勢、性別、吸煙史、糖尿病及結核病治療史等之間的差異無統計學意義(P值均>0.05)。(見表2)。

三、成簇型和獨特型結核分枝桿菌與表型耐藥的相關性分析

本研究將275株結核分枝桿菌分為成簇型和獨特型，分別為165株(60.0%，165/275)和110株(40.0%，110/275)。其中任意耐藥成簇型菌株為46株(27.9%，46/165)，任意耐藥獨特型菌株為31株(28.2%，31/110)。經卡方檢驗，成簇型菌株和獨特型菌株的任意耐藥率無統計學差異，各藥的單耐藥率由于菌株數量太少，無法統計(見表3)。

圖1 VNTR聚類分析樹狀圖

特征分類所有菌株(n=275)耐藥菌株(n=87)OR值(95%CI)χ2值P值年齡 <2025(9．1%)10(40．0%)1．0 20-129(46．9%)42(32．6%)0．7241(0．300-1．748)0．51860．4715 40-81(29．5%)26(32．1%)0．7091(0．281-1．791)0．53180．4659 ≥6040(14．5%)9(22．5%)0．4355(0．146-1．297)2．2780．1313職業 工人31(11．3%)8(25．8%)1．0 農民151(54．9%)39(25．8%)1．001(0．414-2．422)0．0000．9980 學生37(13．5%)14(37．8%)1．750(0．616-4．969)1．1160．2909 其他56(20．4%)26(46．4%)2．429(0．953-6．514)3．5640．0590地勢 山區65(23．6%)23(35．4%)1．00．55290．4571 平原210(76．4%)64(30．5%)0．801(0．445-1．440)性別 女性94(34．2%)28(29．8%)1．00．22580．6347 男性181(65．8%)59(32．6%)1．140(0．664-1．957)吸煙史 無182(66．2%)56(30．8%)1．00．18710．6653 有93(33．8%)31(33．3%)1．125(0．660-1．919)糖尿病 無239(86．9%)75(31．4%)1．00．05520．8143 有36(13．1%)12(33．3%)1．093(0．519-2．303)治療史 初治211(76．7%)51(24．2%)1．023．37<0．0001 復治64(23．3%)36(56．3%)4．034(2．245-7．248)

OR: Odds ratio,相對危險度，以耐藥菌株計算。CI：Confidence interval,可信區間。

四、VNTR多態性檢測

本次共選取了15個特異性較好的VNTR位點來進行檢測分析，結果顯示邢臺地區結核分枝桿菌的不同位點的多態性，即漢高指數(Hunter-Gaston discriminatory index, HGDI)具有較大差異，HGDI值越大表示該位點的多態性越好。一般來說，HGDI>0.60表示分辨能力較高，多態性較好；0.3

討 論

本研究對275株分離自邢臺地區結核病患者痰標本的結核分枝桿菌菌株進行了基因分型和表型耐藥檢測，結果顯示該地區結核分枝桿菌菌株的總耐藥率為31.6%(87/275)，略低于2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查結果(36.8%)[4]。耐兩種及兩種以上抗結核藥物的菌株有60株，占所有菌株的21.8%(60/275)，主要集中在復治患者中，由此分析，長期不規律應用抗生素是造成菌株耐藥的一個重要因素。因此臨床上應規范使用抗結核藥物，根據藥敏結果及時調整治療方案，同時應提高病人用藥的依從性，從源頭上降低耐藥性的產生。

表2 VNTR結果與患者臨床資料之間的相關性

OR: Odds ratio,相對危險度。CI：Confidence interval,可信區間。

表3 成簇型和獨特型與表型耐藥的相關性分析

注：表中括號外數值為各類耐藥的菌株數，括號內數值為“耐藥率(%)”；“-”表示菌株數量太少無法進行統計。

表4 各VNTR位點的等位基因多態性

本研究發現，邢臺地區結核病患者的男女比例為1.93:1(181:94)，各年齡段均有發病，20-30歲患病人數最多，占總數的46.9%，其次是40-50歲，占29.5%。男性患者的菌株耐藥率和VNTR成簇率均高于女性患者的菌株耐藥率和VNTR成簇率，但差異并無統計學意義。劉泓等[5]分析了肺結核患者產生耐藥的危險因素，結果發現耐藥性的產生與性別、年齡、職業、吸煙史等無關，與治療史有關，復治患者產生耐藥的危險性是初治患者的3.324倍，與本文的分析結果一致。

本文通過VNTR基因分型研究發現，邢臺地區結核分枝桿菌呈現明顯的基因型多態性。HGDI值顯示，本研究所采用的15位點VNTR分型技術適合用于邢臺地區結核分枝桿菌的基因分型研究。275株結核分枝桿菌通過VNTR可分為成簇型和獨特型，成簇率為60.0%(165/275)。有文獻報道[6]樣本的成簇率是評價基因分型技術功效的重要指標。本研究所得數值略低于金標法IS6110-RFLP(79%)的結果，而高于Spoligotyping分型的成簇率55%[7]。成簇的例數高達60%以上，提示結核病主要是由于近期感染所致[8]，本研究顯示，邢臺地區結核病疫情近期感染較為嚴重。根據山東[9]、四川[10]報道成簇型菌株的耐藥率顯著高于獨特型菌株的耐藥率，而本研究發現邢臺地區成簇型和獨特型菌株在單耐藥水平和耐多藥水平上無統計學差異，提示近期傳播致病在全敏感菌株和耐藥菌株的發生機制中的作用相當。由于本文所收集的菌株數量不夠大，且時間相對集中，因此不能全面準確反映邢臺地區結核分枝桿菌的基因型分布狀況以及基因型的臨床意義，需要今后收集更多菌株進行深入研究。

近年來，由于結核分枝桿菌耐藥株的廣泛傳播使得全球結核病再度肆虐，主要原因之一就是結核分枝桿菌的變異。因此從分子水平研究結核分枝桿菌的基因特征并進行分型鑒定，明確主要流行菌型，對結核病的有效防治有重要意義。

[1] 趙雁林，王黎霞，成詩明，等.結核分枝桿菌藥物敏感性實驗標準化操作程序及質量保證手冊[M].北京：人民衛生出版社，2013：1-40.

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StudyonVNTRgenotypesanddrugresistancephenotypesof275mycobacteriumtuberculosisclinicalisolatesfromXingtaiarea

ZHANG Zhi, LI Ya-nan, GAO Hui-xia, XUYi, DAI Er-hei

the Fifth Hospital of Shijiazhuang, Shijiazhuang, Hebei 050021, China

ObjectiveTo understand the characteristics of genotypes and drug resistance phenotypes of mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Xingtai and to explore the association of genotypes and drug resistance phenotypes.MethodsThe mycobacterium tuberculosis clinical strains isolated from TB patients in the Fifth Hospital of Xingtai and the corresponding clinical information of the patients were collected from January 2014 to October 2014. The 15-locus variable number tandem repeats (VNTR) was used to genotype the strains, and the first-line anti-TB drug susceptibility testing was performed using the proportion method. Clustering analysis was done by BioNumerics 5.0 software and statistical analysis was done by SPSS 16.0 software.ResultsThe total drug resistance rate of MTB in this district was 31.6%, the initial drug resistance rate was 24.2%, and the acquired drug resistance rate was 56.3%. The drug resistance level of re-treatment was significantly higher than that of new cases. The 275 MTB strains were divided into 145 VNTR genotypes, of which 165 strains were clustered into 35 groups and 110 strains were individual types. The HGDI value of VNTR was 0.9838. There was no significant difference in age, gender, occupation, geographical location, treatment history, smoking history or diabetes history, and no statistical difference was observed between the clustered genotypes and individual genotypes in mono-drug resistance rate and multi-drug resistance rate.ConclusionThe mycobacterium tuberculosis isolates from Xingtai exhibit high genetic diversity. No correlation is observed between VNTR genotypes and drug resistance phenotypes in this study.

mycobacterium tuberculosis; genotype; variable number tandem repeats

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.010.037

河北省衛生廳科研項目(No 20150155)

050021 河北 石家莊，石家莊市第五醫院檢驗科

戴二黑，E-mail:daieh2008@126.com

2017-02-17]