重癥哮喘發病機制的研究進展

郭海琴 馬文嫻 吳昌歸

重癥哮喘發病機制的研究進展

郭海琴 馬文嫻 吳昌歸

根據國內外指南，重癥哮喘(severe asthma, SA)是指哮喘診斷明確，合并癥已排除或得到妥善處理，在過去的1年需GINA 4-5級哮喘藥物治療(大劑量吸入性糖皮質激素(inhaled corticosteroids, ICS)聯合一種控制藥物)，或全身激素治療≥50%的時間，才能控制或仍未控制的哮喘[1-2]。目前全球范圍內約有三億哮喘患者，其中SA約占5%-10%，但由SA所產生的醫療負擔超過哮喘總費用的50%。亞太小組一項調查顯示7個發達國家的哮喘患者中，即使在良好的患者依從性、正確吸入藥物及合并癥得到妥善處理的情況下，仍有160萬未控制SA患者[3]。由于SA發病機制不清，早期提出預警、早期干預是目前亟待解決的問題。本文結合近年來的研究結果，對這些問題進行綜述。

哮喘是一種主要由嗜酸性粒細胞(EOS)、嗜堿性粒細胞、淋巴細胞、肥大細胞(MC)、呼吸道上皮細胞等細胞及組分參與的慢性變應性炎癥為特征的異質性疾病，具有發作性的喘息、氣促、胸悶和咳嗽的呼吸道癥狀，伴有可變的氣流受限，呼吸道癥狀和強度可隨時間而變化[2]。目前哮喘治療的常用藥物有吸入型糖皮質激素(ICS)、短效β2受體激動劑(SABA)、長效β2受體激動劑(LABA)白三烯調節劑(LTRA)和茶堿類等，但常規的吸入甚至口服激素對SA療效不佳，肺功能還可能進行性惡化，嚴重影響患者生活質量，加重家庭及國家經濟負擔[1]。近年多項研究發現SA在接受激素治療后，支氣管黏膜下組織或支氣管肺泡灌洗液(BALFs)中仍存在較高水平多形核中性粒細胞(PMN)，部分患者為持續高水平EOS浸潤，多種免疫因子也參與其中，具體機制不清[4]。本文從激素抵抗性、基因多態性、免疫-炎癥反應及氣道重塑幾個方面就SA的發病機制作一簡單綜述。

激素抵抗性

SA普遍存在著糖皮質激素不敏感的問題，常需吸入大劑量或全身應用糖皮質激素(GCs)才能控制或仍不能控制，產生這種現象的機制尚不完全清楚，可能與以下因素有關：

一、原發性激素抵抗：糖皮質激素受體(GR)突變體及單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNPs)

1 ER22/EK23突變：正常情況下，糖皮質激素受體α(GR-α)在機體廣泛表達并調控靶基因的表達，GR-β表達水平相對較低。糖皮質激素主要是通過與GR-α結合發揮其生物學效應，GR-β拮抗GR-α的功能。當ER22/EK23突變時，無功能的GR-β表達增加，進而影響GCs與GR結合發揮生物學效應，可能是SA激素治療抵抗的原因之一[5]。

2 GR SNPs：包括D641V、N363S、R477H、I559N、R23K、G679S、V729I、I747M等，影響基因轉錄過程，使GR表達減少并影響其生物活性，還可降低GR與配體結合的親和力，此為激素抵抗的主要原因[6]。Feng等[6]研究發現GR-α突變體D641V與激素抵抗型哮喘相關。

3 MDR1 SNPs：有研究發現多藥耐藥基因 MDR1編碼P-糖蛋白170，可促進GCs排出細胞外；高MDR1表達可能參與SA的激素抵抗[7]。

4 Bcll限制片段長度多態性：使機體對GCs敏感性降低，可能參與SA激素治療不敏感[5]。

二、獲得性激素抵抗

1 GR修飾

(2)氧化還原反應：Stephenson等[11]發現巰基氧化還原反應的過程可促進GR翻譯后修飾并抑制GR的功能，GCs與GR結合受抑，導致SA患者的激素抵抗性。絲氨酸磷酸化、半胱氨酸氧化過程與此類似。

2 促炎轉錄因子活化或表達增加

(1) JNK/AP-1：JNK是MAPK家族成員之一，可被TNF-α等促炎因子激活，直接使GR磷酸化，抑制其核轉移過程，減少與GRE結合[7]。轉錄激活蛋白1(AP-1，JunB和c-Fos)組分JunB對TH2細胞的生成至關重要。JunB-Batf-IRF4復合物與IL-17基因啟動子上的AP1-IRF復合物(AICE)結合，誘導IL-17基因表達。JNK/AP-1途徑激活，促炎轉錄因子表達增高，是SA激素抵抗原因之一[12]。c-Fos還可直接拮抗GR，引起激素抵抗。

(2)JAK3/STAT5:有研究發現，JAK3/STAT5途徑激活，IL-2可使GR核轉位受抑，參與激素抵抗[5, 7]。

(3) NF-κB:NF-κB有P50和P65亞基，參與免疫反應的許多因子都受NF-B的調控，包括：TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、iNOS、COX2、趨化因子、粘附分子、集落刺激因子等；NF-κB對TH2細胞分化也至關重要[13]。已有研究表明NF-κB調控生成的多種組分及因子可能參與SA的發生發展，IL-1β、IL-8和巨噬細胞抑制蛋白1α等與GCs抵抗有關，進一步論證了NF-κB在SA發病機理中的作用[14]。Ghonim等[13]發現絲氨酸殘基20位點處NF-κB P50亞基磷酸化，還可能影響DNA依賴性蛋白激酶(DNA-PK)調控VCAM-1表達，參與SA的氣道重塑。

3 細胞因子誘導GR-β表達增加：Semlali等[15]研究發現IL-17A和IL-17F可促進GR-β表達，引起激素抵抗。

4 組蛋白乙酰化障礙：Trevor等[16]研究表明HDAC2可使GR去乙酰化，GC與NF-κB結合并激活AP-1形成GC-NFκB/AP-1復合體，抑制促炎因子轉錄，促炎因子合成減少；此外，HDAC2可使組蛋白去乙酰化也可使促炎因子表達下調參與其抗炎作用。HDAC2表達或活性降低，GCs抗炎作用減弱，導致激素治療不敏感。Ito等[17]在40名受試者的支氣管黏膜活檢組織中也發現HDAC2表達水平與哮喘患者的激素療效有關。而氧化應激時，PI3Kδ被激活，Akt磷酸化，組蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)磷酸化后活性降低；過氧亞硝酸鹽刺激、組蛋白4賴氨酸5乙酰化減弱等都會引起HDAC2活性降低，可能參與SA的發病機制[18]。

基因多態性

近年來多項研究表明，SA患者與輕中度哮喘患者或健康對照者相比，在遺傳學上存在差異，其中最主要的有：細胞因子SNPs、維生素D受體(VDR)SNPs、自噬相關基因Atg5及Atg7 SNPs、YKL-40 SNPs、TSLP SNPs、RORα SNPs等。

一、細胞因子及其SNPs

1 IL-17及IL-17 SNP：有研究發現，IL-17水平及IL-17 SNP rs2275913與SA相關[19]。Th17、iNKT、Trδ等細胞都可產生IL-17，其可誘導上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞等合成并分泌IL-6、IL-8、G-CSF、PGE2，促進ICAM-1的表達[20]。IL-17和IL-17R結合后，可通過MAPK和NF-κB途徑發揮其生物學作用，是重要的促炎因子；IL-17還可激活PI3K途徑，降低HDAC2活性。其組分IL-17A可引起AHR，還可介導激活先天性免疫系統，促進上皮細胞分泌PMN趨化因子CXCL1和CXCL5，招募并活化PMN，加重SA。IL-22還可加強IL-17A的促炎反應。Nanzer等[21]發現，激素抵抗型哮喘患者血清/BALF中IL-17A水平較激素敏感患者高，抗IL-17A單抗Ixekizumab也被證實對SA具有療效，進一步說明了IL-17濃度升高及IL-17 SNP可能是SA激素治療不敏感的原因之一。

2 IL-33和IL-33受體(ST2L)：IL-33屬于IL-1家族成員，在氣道上皮和平滑肌中表達，可促進RBM增厚；IL1RL1編碼ST2L和可溶性誘餌受體(sST2)，活化NF-κB和MAPK，促進TH2細胞因子的產生，加強炎癥反應[22]。Traister等[23]研究發現，SA患者ST2L mRNA較健康對照組表達顯著升高，BALFs ST2L濃度較輕中度哮喘患者和健康對照者均高；與ST2L mRNA和/或sST2水平相關的IL1RL1 SNPs(rs1420101, rs1420089, rs1041973, rs1921622和 rs10185897)與哮喘相關聯，且sST2水平與IFN-γ mRNA表達增高一致。sST2可通過促進IL-33/ST2L結合，調控IFN-γ 的表達；ST2L也可反饋調節sST2表達。研究還發現，在接受大劑量吸入/口服GCs或使用LTRAs后IL-33、ST2L mRNA仍處于較高水平，且ST2L mRNA與TH2型炎癥標志物如血EOS計數、FeNO、CLCA1及CCL26 mRNA表達增高一致[22]，也充分解釋了部分SA患者在接受大劑量GCs后EOS仍處于較高水平這一現象。

3 IL-6和IL-6受體(IL-6R)：重癥哮喘研究計劃(SARP)小組等[23]研究發現，IL-6R編碼的SNP rs2228145(Asp358Ala)與SA患者肺功能一秒用力呼氣容積占預計值百分比(FEV1%pred)降低和AHR相關，且SA患者血清中sIL-6R水平較輕中度哮喘患者高。Asp358Ala變異修飾IL-6R肽結構，使其水解分泌至細胞外為sIL-6R，與廣泛分布的gp130結合形成sIL-6R/gp130復合體，誘導激活JAK2，信號轉導子磷酸化，轉錄因子3活化，進入細胞核影響炎癥基因表達；IL-6也可激活sIL-6R，促進促炎因子生成[24]。Ferreira等[25]在GWAS研究發現，IL-6R SNP rs4129267與IL-6R SNP rs2228145相關。也就是說IL-6R SNP rs2228145、SNP rs4129267及IL-6都可能參與SA發病過程。

4 IL-4和IL-4Rα SNPs：Ricciardolo等[26]發現IL-4 SNPs和IL-4Rα SNPs與SA相關。IL-4主要由活化Th2細胞產生，可上調VCAM-1的表達，刺激氣道平滑肌和上皮細胞產生ECP，招募EOS至呼吸道[27]。IL-4R由IL-4Rα和IL-13Rα1組成，即IL-4與IL-13有部分相同受體，故IL-13可能與IL-4在參與SA發病中有協同作用。抗IL-4Rα mAb Dupilumab可抑制IL-4/IL-13，且CCL26、CCL17也受其調控，對SA療效顯著且安全[28]。

5 TNF-α及TNF-α SNPs：Erry等[29]發現，SA患者較輕中度哮喘患者和/或正常對照者TNF-α及TNF-αR1表達增加；Gagliardo等[30]的研究結果提示；TNF-α SNPs與SA相關。Howarth等[31]也發現激素依賴的SA患者BALFs TNF-α水平較輕中度哮喘患者更高，TNF-α基因表達增加。TNF-α作為一種廣泛的促炎因子，同IL-1β共同誘導PMN自噬，PMN自噬與NETs(extracellular DNA traps)可通過破壞氣道上皮細胞、誘導IL-8生成、活化EOS、加劇氣道炎癥，參與SA的形成和發展；有研究表明：在SA患者中使PMN活化的炎癥因子如IL-8、TNF-α、IL-1β等表達上調[14]。但多項臨床隨機對照試驗結果顯示，抗TNF-α mAb Etanercept對SA的療效不盡一致，可能跟隨訪時間及個體異質性等有關[31-32]。

6 其他：Walker等[33]研究發現IL-18R SNPs與SA相關。IL-18作為促炎因子，與IL-33有協同作用，誘導IFN-γ表達；它還能增強IL-2、GM-CSF活性。有研究發現TGF-β1 SNPs與SA相關聯。TGF-β對細胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調節作用，還可能通過對IL-6基因轉錄的調節促進IL-6的產生[27]。

二、VDR SNPs及VitD

Einisman等[34]發現哮喘患者VDR SNPs FokI、1,25(OH)2D3不足與其激素治療能否控制癥狀有關。已有研究證實低水平VitD會提高SA發病風險、哮喘患者ASM增厚、SA急性加重頻率增高、控制所用激素量增加[35]。VitD可通過誘導Treg細胞產生IL-10，提高激素敏感性，減少呼吸道感染風險，抑制氣道重塑等來防止SA的發展；其還與TNF-α水平呈負相關[21]。也有研究發現1,25(OH)2D3可抑制IL-17A和IL-22的表達，增強CD39+T細胞的表達[25]。

三、Atg5與Atg7 SNPs

Atg5 SNPs、Atg7 SNPs可引起肺 CD11C+、PMN細胞自噬障礙，加強SA患者中性粒細胞性氣道炎癥和AHR，進一步加重SA，惡性循環；且CD11C+細胞自噬障礙可誘導TH17細胞極化，IL-17A過表達，加重哮喘[36]。已有隨機臨床試驗表明，自噬誘導劑卡馬西平，對SA有顯著療效[37]。也有小鼠模型研究發現，敲除了Atg5 和Atg7的小鼠，其PMN脫顆粒減少，介導的炎癥反應減弱[14]。充分說明了Atg5 SNPs、Atg7 SNPs可能參與SA發生發展。

四、YKL-40 SNPs

甲殼素是昆蟲、甲殼動物、寄生蟲、真菌、細菌等多種生物保護機體不受惡劣環境影響的結構多糖，殼三糖酶和YKL-40是人體表達的能降解甲殼素的酶[38]。肺泡巨噬細胞是YKL-40的主要來源，其可儲存在PMN的特殊顆粒中，并在PMN激活后釋放至血漿中。Otsuka等[38]發現YKL-40水平與PMN水平呈正相關。YKL-40以一種劑量依賴方式刺激組織細胞如成纖維細胞等，與胰島素樣生長因子1(IGF-1)協同調節多種細胞的生存、黏附、遷移和增殖能力；與膠原Ⅰ結合調節膠原纖維的生成，致氣道上皮下纖維化和新生血管形成，促進氣道重塑。支氣管上皮細胞在高水平YKL-40條件下產生高水平的IL-8；IL-8在活化蛋白酶受體2的作用下刺激支氣管平滑肌增殖，其對PMN有趨化作用，進一步加強炎癥反應[39]。有研究發現幾丁質酶3樣1(CHI3L1)SNP rs12141494、幾丁質酶1(CHIT1)SNP rs4950928與SA、YKL-40水平和持續性氣流受限相關；CHI3L1 SNP rs12141494與CHIT1 SNP rs4950928可能存在協同作用[40].

五、Nrf2 SNPs

Nrf2是帶亮氨酸支鏈基序，調控氧化還原反應的一種轉錄因子，幾乎所有組織都有表達。其被抑制蛋白Keap1隔離在細胞質中，在氧化應激時激活并轉移至細胞核，與抗氧化應答元件(ARE)結合并激活ARE，上調幾種與還原型谷胱甘肽(GSH)合成和抗氧化防御有關的基因表達[41]。McMahon等[41]研究發現SA患兒Nrf2 mRNA和蛋白質表達增加，但卻存在功能缺陷；這種功能缺陷，可能是因Keap1引起Nrf2泛素化及其蛋白體降解所致。Nrf2乙酰化、Nrf2磷酸化及Nrf2 SNPs還可導致GSH呈負平衡狀態，組蛋白乙酰轉移酶(Histone acetyltransferases , HAT)活性增加，組蛋白去乙酰化酶(HDAC)活性降低，使組蛋白乙酰化最終加強IL-8等促炎因子的表達，進一步促進AHR和氣道重塑，參與SA[42]。

六、其他

有研究發現TSLP SNPs、RORα SNPs與SA相關聯，SA患者S100鈣結合蛋白mRNA和CEACAM家族mRNA基因表達也上調，金屬蛋白酶33 SNPs與哮喘嚴重程度、肺功能降低和哮喘急性加重相關[27, 33]。

免疫-炎癥

哮喘是由多種細胞及炎癥因子介導的慢性炎癥性疾病，以下簡要闡述了SA可能存在的免疫-炎癥機制。

一、固有免疫

1 PMN：歐洲重癥哮喘發病機制研究(ENFUMOSA)等多項研究發現，與輕中度哮喘患者相比，SA患者氣道黏膜下或BALF中有大量PMN浸潤[43]。如上述，PMN與TH17細胞、IL-17、TNF-α、IL-1β、IL-8、CXCR2、CXCL1、CXCL5、MSK1、P38 MAPK等相互交織相互作用影響，加重氣道炎癥反應；且PMN激活后釋放一系列相關酶如MPO、MMP9、NE等，加重氣道上皮的破壞，氣道重塑，促進SA發展[4]。GCs還可能通過抑制PMN的凋亡使PMN水平升高，促進上述炎癥反應，這也可能是SA患者對激素存在抵抗的原因之一[14, 20]。PMN的趨化、活化、凋亡的異常都可能引起患者呼吸道持續性炎性反應，促進SA發展。

2 EOS：在以往的認識中，嗜酸性粒細胞性氣道炎癥對GCs敏感；但也有文獻報道有的SA患者在接受大劑量吸入或口服激素后誘導痰中EOS持續處于高水平，有報道稱40-60%的SA為嗜酸性粒細胞性氣道炎癥[44]。Smith等[45]發現SA患者血液/氣道嗜酸性粒細胞造血祖細胞(EOPs)水平較輕中度哮喘患者高，SA持續高水平EOS可能與EOP升高有關；EOS持續存在的哮喘患者氣道黏膜下巨噬細胞和TGF-β(+)細胞水平高。EOS持續高水平的SA可能涉及與IL-4、IL-5、IL-13及TGF-β等的相互作用，而這些因子又涉及一個復雜的免疫系統網，共同導致SA的發病[46]。已有研究證實，Benrelizumab、Reslizumab、Mepolizumab、Dupilumab等mAb已被用于治療嗜酸性粒細胞性SA且取得了良好療效，進一步說明了EOS是參與SA發病的重要細胞[28,47]。

3 肥大細胞：Lezmi[48]等研究發現，小兒SA患者ASM或黏膜下層肥大細胞(MCs)水平與EOS浸潤數量及患者急性加重頻率正相關。MCs可通過分泌粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、PGD2及CCR3募集EOS至氣道黏膜下層，促進抗炎反應，參與SA。

二、II型固有淋巴樣細胞(ILC2s)

有研究發現SA患者BALF ILC2s水平較輕中度哮喘患者高，且ILC2s水平與IL-33正相關[49]。ILC2s是一種非T非B淋巴細胞，介于固有免疫和適應性免疫之間；在IL-25、IL-33、TSLP等作用下產生大量IL-5、IL-13和少量IL-4，CCL26表達增多，招募活化EOS，嗜酸性粒細胞性炎癥反應增強。即ILC2s可能通過加強機體內固有免疫和適應性免疫反應，在SA的發生發展中起重要作用。

三、適應性免疫

4 脂氧素：脂氧素，由5-脂氧合酶與15-脂氧合酶作用產生的介質，有強烈的抗炎作用。Vachier等[52]發現SA患者較輕中度哮喘患者痰液中脂氧素4(LX4)含量較低；脂氧合酶衍生的類花生四烯酸比率失衡也與哮喘氣流受限的程度相關[27]。

氣道重塑

重癥哮喘主要病理生理學改變主要AHR、炎癥和氣道重塑；氣道重塑包括氣道上皮完整性的破壞、網狀基底膜(RBM)增厚、細胞外基質沉積、新生血管形成、ASM細胞增生肥大、杯狀細胞化生、粘液腺增生[53]。嚴重的氣道重塑將導致不可逆轉的氣流受限。

從上文可知，EOS、IL-4、IL-5、IL-13、纖維細胞因子TGF-β、VitD等可促進ASM增厚，IL-33促進RBM增厚，IL-17促進ICAM-1表達及誘導成纖維細胞分泌大量炎癥因子，YKL-40刺激成纖維細胞與Ⅰ型膠原結合調節膠原纖維的生成，PMN與TH17細胞、IL-17、IL-8、MPO、NE、MMP-9等相互作用，ILC2s通過CCL26、IL-33及TH2細胞因子的作用，各細胞及組分相互影響作用，形成一個錯綜復雜的系統，參與SA的氣道重塑。

一、成纖維細胞及C-C家族趨化因子受體6型(CCR6)及7型(CCR7)

SA患者血循環中成纖維細胞數量較多，且有更強的肌纖維母細胞分化潛能；其ASM中CCR7趨化因子配體19表達增加。成纖維細胞在CCR6、CCR7的作用下遷移至肺組織并定植于氣道壁，分泌膠原和平滑肌肌動蛋白α(α-SMA)、細胞外基質蛋白；其分化為肌纖維母細胞后，釋放細胞外基質蛋白，介導上皮下纖維化，促進SA氣道重塑[54]。

二、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)

Blondin等[55]發現發現SA患者ASM/BALF含高水平MMP-9，是氣道重塑的一個敏感性標志物。其還與IL-33水平正相關，加重嗜酸性粒細胞性氣道炎癥，參與SA。

綜上所述：SA是一種異質性疾病，同樣的臨床表型可能存在不同的分子內型，對治療的反應也不盡相同[56]。GR SNPs、GR修飾(磷酸化、亞硝基化、泛素化、氧化還原應激等)、GR-β表達增加、GCs細胞外排增加、促炎轉錄如JNK/AP-1、NF-κB、JAK3/ATAT5等信號途徑過度激活及促炎轉錄因子過度表達、組蛋白乙酰化障礙等都可能引起SA存在激素治療不敏感，病情不能控制。PMN、EOS、MC、ILC2s、FOXP3+Treg細胞、TH2/TH17細胞、成纖維細胞、肺泡巨噬細胞、內皮細胞、上皮細胞、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-12、IL-13、IL-17、IL-22、IL-25、IL-33、及TGF-β、TNF-α、IL-1β、MMP9、VitD、LX4、PGD2、YKL-40、巨噬細胞抑制蛋白1α、CCR6、CCR7、CCL26等多種細胞及組分都可能參與了SA的發生發展過程。各種細胞及組分相互影響，共同作用引起患者激素抵抗、炎癥反應增強、AHR及氣道重塑，致SA。針對上述SA發病機制，目前已有的新型治療方案有：抗炎(磷酸二酯酶4抑制劑、NF-κB抑制劑、IL-5 mAb等)、抗氧化劑、免疫抑制劑、P38 MAPK抑制劑、HDAC2活性增強劑(茶堿、磷酸肌醇-3激酶-δ抑制劑)、VitD、巨噬細胞抑制因子和P-糖蛋白抑制劑、支氣管熱成形術等，從反方向證實了其可能參與了SA發病機制[7, 57]。因為SA為異質性疾病這一特性，我們需進一步探索出對患者有益的精準治療方案。

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10.3969/j.issn.1009-6663.2017.010.042

國家自然科學基金項目(No 81470223)

710032 陜西 西安，第四軍醫大學西京醫院呼吸內科

吳昌歸，E-mail：changgui@fmmu.edu.cn

2017-01-10]