小細胞肺癌患者循環腫瘤細胞CTC檢測的應用價值評估

葛含天　王達飛

[摘要] 目的 分析小細胞肺癌（SCLC）者循環腫瘤細胞（CTC）檢測的應用價值情況。方法 便利選擇2013年12月—2016年12月寶應縣人民醫院收治的288例SCLC者為研究對象，另取健康體檢者70名，良性疾病組56例為對照者。使用免疫磁珠陰性富集和免疫熒光化學染色法，分析靜脈血內CD45-/CTC/CK18+數量，隨訪104例化療者，分析SCLC者CTC檢測價值。結果 和良性疾病者（3.57%）以及對照組（5.71%）相比，SCLC組（64.58%）的CTC檢查結果差異有統計學意義（P<0.05）。對照組中CTC陽性率為5.7%，SCLC者臨床分期IIIA，IIIB和IV期陽性率分別為32.1%，56.9%以及78.1%。組間數據差異有統計學意義（P<0.05）。經單變量分析證實，腫瘤T和N分期與CTC陽性無相關性，遠處轉移與其結果呈正相關（P<0.05）。陰性富集腫瘤回收率為92.0%，陽性對照細胞株H460和A549經熒光抗體染色后上述兩種細胞株中存在細胞角蛋白CK18以及CK19。肺癌者敏感性以及特異性為98.2%以及72.9%。調查區間內生存者共計248例CTC數量為2～4個，無顯著上升，其臨床特征為CTC陽性全身多發性轉移，PS分數低。結論 該實驗所使用的檢測方式簡便可行，特異性和敏感性較高，CTC陽性和疾病分期，是否吸煙，治療效果和轉移呈現相關性，CTC越高，證實患者預后不良

[關鍵詞] CTC；角蛋白18相關抗原；免疫磁珠

[中圖分類號] R5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）08（a）-0046-03

[Abstracts] Objective This paper tries to analyze the application value of circulating tumor cells（CTC） inspection on small cell lung cancer（SCLC）. Methods 288 cases of SCLC from December 2013 to December 2016 in Baoying People's hospital were selected， 70 cases of healthy physical examination， 56 cases of benign disease as the control group. the number of venous CD45-/CTC/CK18+， CTC detection value of SCLC among the follow-up of 104 cases of chemotherapy were analyzed through negative immune magnetic beads enrichment and immunofluorescence chemical dyeing method. Results CTC test results of benign disease was 3.57% and that of the control group was 5.71%， SCLC group was 64.58%， and there were statistical differences（P<0.05）. CTC positive rate was 5.7% in control group， positive rate of the clinical stage IIIA， stage IIIB and IV of the SCLC group were 32.1%， 56.9% and 78.1%. There was difference between the groups （P<0.05）. Confirmed by univariate analysis， there was no correlation between the tumor T and N stage and CTC positive， and there was positively correlation between distant metastasis and its results（P<0.05）. Negative enrichment tumor recovery was 92.0%， the positive control cell line A549 and H460 by fluorescent antibody staining of the above two kinds of cell lines existed cytokeratin CK18 and CK19. Sensitivity and specificity of lung cancer was 98.2% and 72.9% respectively. Among the 248 cases of survivals CTC number were 2 to 4， with no significant increase， and with the clinical features of multiple transfers of CTC positive， and low PS score. Conclusion Inspection method in this study is simple and feasible， high specificity and sensitivity. There is correlation between the CTC positive and disease staging， smoking， treatment effect and transfers， the higher the CTC is， the poor condition of the patients have.endprint

[Key words] CTC； Keratin 18 related antigen； Immunemagnetic beads

現如今，我國的肺癌發生率已經躍居世界之首[1-2]。當癌細胞進入到血液循環之后，一般經過免疫系統以及血液流動學轉移，極少數腫瘤細胞會隨著血液的流動而形成轉移病灶。循環腫瘤細胞（CTC）在機體內水平代表了癌細胞血性轉移水平，CTC在檢測SCLC疾病的在早期診斷，監控復發轉移以及判斷預后結果等方面，均具有一定臨床意義。結合實際情況，該文便利選擇2013年12月—2016年12月該院收治的288例SCLC者為研究對象，并設立對照組以及良性肺部疾病組，全面分析該疾病患者的CTC檢測應用價值情況，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該文便利選擇該院收治的288例SCLC者為研究對象，另取健康體檢者70名，良性疾病組56例為對照者。

1.2 方法

①樣本收集：使用真空采血管，收集病患肘部正中靜脈血。為避免靜脈穿刺過程內發生上皮細胞污染，不收集前2 mL血。收集后7.5 mL血液，后分別放置在ACD抗凝管內。②磁珠富集：將收集好的血液在48 h內完成CD45磁珠富集環節。③細胞固定：將通過以上步驟取得的細胞沉淀物質，放在立離心管管底，加入劑量為40 μL的ASI液懸浮細胞沉淀，吹打沉淀。后將混合好的細胞液加入完成包被的Cytospin玻片中央加樣區，在室溫環境下靜止1～2 h，等到玻片干燥之后，實施染色，并將其放置在-80℃環境下保存。④細胞的化學染色，固定和顯色：在暗室內，于玻片中滴入CD45抗體以及抗CK8，CK19以及CK19抗體以及0.2%BSA熒光體，靜置1.5 h，后分別對TBS以及20%的BSA清洗3次，完成后，于細胞區域內加入內含DAPI熒光計數液7 μL，加蓋玻片固定封存。完成所有步驟以后，可以在4℃環境下存儲或立即使用顯微鏡觀察計數。⑤PanCK染色：完成固定封片后，加PanCK染色。

1.3 統計方法

該實驗使用SPSS 21.0統計學軟件分析數據，計數資料用[n（%）]表示，使用χ2計算，使用Spearmans相關性并分析法，進行相關性分析，多變量分析使用Logistic回歸分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 受試者基線資料情況

該實驗一共納入SCLC者288例。經比較分析，和良性疾病者（3.57%）以及對照組（5.71%）相比，SCLC組（64.58%）的CTC檢查結果差異有統計學意義（P<0.05），詳細見表1。

2.2 健康者以及良性病變者、SCLC者CTC檢查結果情況

對照組中CTC陽性率為5.7%，2例CTC陽性者數值在2～2 631個，中位值11個，男性以及女性陽性率為65.2%以及64.3%。CTC未吸煙者占46.0%，吸煙史/正在吸煙者79.5%，組間數據差異有統計學意義（P<0.05）。臨床分期IIIA，IIIB和IV期陽性率分別為32.1%，56.9%以及78.1%。組間數據差異有統計學意義（P<0.05）。經單變量分析證實，腫瘤T和N分期與CTC陽性無相關性，遠處轉移與其結果呈正相關（P<0.05）。

2.3 細胞富集染色情況

陰性富集腫瘤回收率為92.0%，陽性對照細胞株H460和A549經熒光抗體染色后，存在綠色和紅色熒光分布，疊加后為同一細胞，證實上述2種細胞株中存在細胞角蛋白CK18以及CK19。肺癌者敏感性以及特異性為98.2%以及72.9%。

2.4 SCLC者治療前后CTC分布情況

該實驗對104例患者完成隨訪，結果詳見表2、及表3。

2.5 患者長期預后相關性情況

在288例SCLC者中，死亡40例。與采樣時間點相隔時間為0.5～3.7個月，中位數為1.2個月。該部分患者中，CTC數量為2～4個，無顯著上升，其臨床特征為CTC陽性全身多發性轉移，PS分數低，證實CTC不可視為SCLC的預后指標，應聯合患者的其他臨床特征展開檢測。

3 討論

3.1 SCLC者臨床分級和CTC相關性分析

該實驗指出，經單變量分析證實，腫瘤T和N分期與CTC陽性無相關性，遠處轉移與其結果呈正相關（P<0.05）。有文獻指出[3]，循環細胞檢出率和臨床分期不存在相關性，出現這種結果的原因可能和納入樣本量、不同檢查方式等存在差異有關。

3.2 檢測方式尚具有提升空間

該文使用了CK蛋白對癌癥者CTC進行標記，特異性為72.9%，CK18、CK19是上皮細胞高表達結構蛋白，其在SCLC者中表達量高。但這種測試方式陽性率較低。CK家族在標記脫落細胞能力弱。出現這種情況的原因可能和癌細胞逃逸過程中出現“白細胞化”存在相關性。由于癌細胞在脫落、轉移以及定植過程中，會發生類似白細胞Rolling以及爬移形式，在此同時會伴隨細胞骨架結構改變，引起CK水平降低[4-5]。

3.3 化療與CTC之間的關聯性

該次結果實驗指出，患者CTC數量在化療前后存在明顯差異。雖說完成治療后，部分患者依舊有少量的CTC，但與治療前相比（P<0.05）。該次實驗中，有12例病患的CTC指標治療后較治療前高，6例不久后疾病惡化，另外6例穩定，在SD者中，2例曾為CR，后轉為陽性。有文獻證實[6]，腫瘤規格和CTC數量存在相關性。或者當癌瘤體積縮小后，癌組織以及會對微血管造成侵蝕。癌細胞就此落入血液循環，產生微轉移。基于當前對于癌細胞參加血液循環時間規律以及CTC衰變周期尚無準確定義，因此在實際工作中應當多點，多次檢測CTC更為合理[7]。

當前，諸多學者對于CTC和預后相關性進行研究，認為在治療前和治療后初次復診時CTC多少在和預后情況存在相關性[8]。該實驗研究時間跨度短，病例數不多，因此關于SCLC者循環腫瘤細胞（CTC）檢測的應用價值有待進一步商榷。

[參考文獻]

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（收稿日期：2017-05-06）endprint