細(xì)胞膜通透性的調(diào)節(jié)對(duì)木醋桿菌產(chǎn)細(xì)菌纖維素的影響

湯衛(wèi)華賈士儒

（1天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，天津300350） （2天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

細(xì)胞膜通透性的調(diào)節(jié)對(duì)木醋桿菌產(chǎn)細(xì)菌纖維素的影響

湯衛(wèi)華1*賈士儒2

（1天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，天津300350） （2天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

細(xì)菌纖維素（Bacterial cellulose，BC）是一些細(xì)菌的初級(jí)代謝產(chǎn)物，主要起到保護(hù)層的作用。BC在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與植物纖維是相同的，但其極為精致的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)賦予了BC更多的性能。因此BC在醫(yī)用材料、造紙、紡織以及食品等領(lǐng)域中有廣泛的應(yīng)用。近幾年來(lái)，BC已成為研究的熱點(diǎn)，但由于成本高、產(chǎn)量低、技術(shù)轉(zhuǎn)化脫節(jié)等問(wèn)題，使BC難以實(shí)現(xiàn)規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。

人為改變細(xì)胞膜的通透性，可以改變?cè)系妮斎牖虼x產(chǎn)物的排出速率，同時(shí)也可能對(duì)細(xì)胞造成損傷，這是實(shí)現(xiàn)代謝人工調(diào)控的重要方法之一。在微生物代謝中，改變細(xì)胞膜通透性是有效生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的一種常用方法。BC的生物合成是一個(gè)極其復(fù)雜的生化過(guò)程，受到諸多因素的影響，細(xì)胞膜通透性就是其影響因素之一。目前僅有鄧毛程等人在這方面進(jìn)行了初步探討。本文采用化學(xué)法（添加表面活性劑和有機(jī)溶劑）和物理法（超聲波），綜合研究細(xì)胞膜通透性的調(diào)節(jié)對(duì)木醋桿菌產(chǎn)BC的影響。

1 材料與方法

1.1 菌種

M12木醋桿菌（Acetobacter xylinum），天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基的配制：取胰蛋白胨5 g，酵母粉5 g，檸檬酸1 g，葡萄糖20 g，Na2HPO45 g，加蒸餾水1000mL，加熱溶解，調(diào)整pH為6.0，121℃滅菌20min。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

將1～2環(huán)斜面種子接入裝有50mL～100mL液體種子培養(yǎng)基的三角瓶中，在30℃下160 r/min培養(yǎng) 24 h～30 h。

1.3.2 液體培養(yǎng)

以體積分?jǐn)?shù)6%的接種量接入液體培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)6 d。

1.4 分析方法

1.4.1 BC的提取和處理方法

培養(yǎng)結(jié)束后將膜取出，用水多次沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)。再將膜浸泡于0.1 mol/L的NaOH溶液，100℃煮沸20min，去除液膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基，膜呈乳白色半透明。然后用蒸餾水多次沖洗，用pH試紙輕壓膜測(cè)pH值，約7.2。80℃干燥至恒重，進(jìn)行稱重。纖維素的產(chǎn)量表示為：g纖維素/L培養(yǎng)基。

1.4.2 菌體量的測(cè)定

用0.85%的生理鹽水配制pH為4.6～4.8的0.1 mol/L的醋酸鉀－醋酸緩沖溶液100mL，取纖維素酶2 g放入緩沖溶液中活化，置冰箱備用。測(cè)定時(shí)，每次取活化好的纖維素酶溶液2mL在50℃、pH 5.0條件下充分水解2 h，適當(dāng)稀釋后，于600nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光值（OD600nm值）。

2 結(jié)果與討論

2.1 吐溫-80添加量對(duì)BC產(chǎn)量的影響

以體積分?jǐn)?shù)6%的接種量接入液體培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)24 h后，在液體培養(yǎng)基中分別添加1%、2%、4%、6%、8%的吐溫-80（已滅菌），研究吐溫-80添加量對(duì)木醋桿菌BC產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 吐溫-80添加量對(duì)BC產(chǎn)量和菌體生長(zhǎng)的影響

由圖1可知，吐溫-80對(duì)BC的生物合成具有明顯的促進(jìn)作用。隨著吐溫-80添加量提高，BC產(chǎn)量隨之提高；當(dāng)添加量提高至4%時(shí)，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量達(dá)5.9 g/L，是對(duì)照組的1.23倍。吐溫-80添加量進(jìn)一步提高至6%和8%，BC的產(chǎn)量開始下降。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，吐溫-80對(duì)木醋桿菌的生長(zhǎng)沒(méi)有促進(jìn)作用，當(dāng)吐溫-80的添加量小于4%時(shí)，木醋桿菌的生長(zhǎng)受到輕微的抑制作用；而添加量增至6%時(shí)，木醋桿菌的生長(zhǎng)受到明顯的抑制，其菌體量?jī)H為對(duì)照組的72.3%，同時(shí)BC產(chǎn)量開始下降。一般來(lái)講，木醋桿菌生長(zhǎng)的同時(shí)伴隨著BC的分泌，而這個(gè)結(jié)果與該結(jié)論不符。有研究認(rèn)為BC的超細(xì)網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可以保護(hù)木醋桿菌不受外界環(huán)境如高溫、干燥、紫外線燈等惡劣條件的影響，原因可能是木醋桿菌受到外界不利環(huán)境的刺激后，會(huì)加快合成細(xì)菌纖維素來(lái)進(jìn)行自我保護(hù)。該試驗(yàn)結(jié)果與鄧毛程等人的研究結(jié)果相似。

2.2 有機(jī)溶劑對(duì)BC產(chǎn)量的影響

有機(jī)溶劑會(huì)溶解在細(xì)胞膜內(nèi)，破壞細(xì)胞膜的完整性，影響細(xì)胞膜作為屏障和能量轉(zhuǎn)換功能。以體積分?jǐn)?shù)6%的接種量接入液體培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)24 h后，在液體培養(yǎng)基中分別添加不同量的丙酮、氯仿和甲苯，繼續(xù)培養(yǎng)5 d，研究有機(jī)溶劑的種類及添加量對(duì)木醋桿菌BC產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 有機(jī)溶劑對(duì)BC產(chǎn)量和菌體生長(zhǎng)的影響

圖2的結(jié)果表明，有機(jī)溶劑對(duì)BC的生物合成無(wú)明顯的促進(jìn)作用。當(dāng)丙酮添加量為0.5%時(shí)，BC產(chǎn)量達(dá)到5.42 g/L，是對(duì)照組的1.03倍，而進(jìn)一步提高丙酮的添加量，BC產(chǎn)量下降。當(dāng)氯仿和甲苯的添加量為0.5%時(shí)，木醋桿菌的生長(zhǎng)和BC的生物合成均有微量的提高。但是當(dāng)兩者的添加量繼續(xù)提高，菌體生長(zhǎng)和BC合成均受到明顯的抑制。當(dāng)氯仿和甲苯的添加量分別達(dá)到3.0%和1.5%時(shí)，菌體量和BC產(chǎn)量均降至0。

這幾種有機(jī)溶劑中，氯仿和甲苯是一種對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有毒害作用的有機(jī)溶劑，雖然在低濃度情況下，木醋桿菌對(duì)有機(jī)溶劑有一定的耐受性，但是濃度提高后，超過(guò)菌體的耐受性，其會(huì)對(duì)菌體產(chǎn)生毒害作用，導(dǎo)致菌體大量死亡。

2.3 超聲波對(duì)BC產(chǎn)量的影響

超聲波的空化作用和機(jī)械作用可增加細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞膜發(fā)生可以修復(fù)的損傷，從而使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)釋放到細(xì)胞外。以體積分?jǐn)?shù)6%的接種量接入液體培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)24 h后，在一定超聲功率、頻率條件下，分別處理30 s、60 s、90 s、120 s，繼續(xù)培養(yǎng)3 d。考察超聲波對(duì)木醋桿菌生物合成BC的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同超聲時(shí)間對(duì)BC產(chǎn)量的影響

由圖3可知，超聲波對(duì)木醋桿菌生物合成BC具有輕微的促進(jìn)作用。菌體生長(zhǎng)1 d后，采用超聲處理時(shí)間為60 s時(shí)，BC的產(chǎn)量達(dá)到6.31 g/L，是對(duì)照組的1.08倍。繼續(xù)增加超聲處理時(shí)間，BC產(chǎn)量不再繼續(xù)增加。這表明適度的超聲波處理，可促進(jìn)木醋桿菌合成BC。但是處理時(shí)間超過(guò)60 s，會(huì)導(dǎo)致木醋桿菌細(xì)胞的破碎，鏡檢結(jié)果見圖4。該試驗(yàn)結(jié)果與鄧毛程等的研究結(jié)果相似。

圖4 超聲處理對(duì)木醋桿菌菌體的影響

3 結(jié) 論

采用化學(xué)法（吐溫-80和有機(jī)溶劑）和物理法（超聲波）處理木醋桿菌細(xì)胞，對(duì)BC的合成及菌體生長(zhǎng)的均有影響。

a）吐溫-80的添加量增至0.04%，BC的產(chǎn)量是對(duì)照組的1.23倍，但是菌體量下降了11.6%。這說(shuō)明吐溫-80一方面可以促進(jìn)BC的合成，另一方面能對(duì)菌體細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用。

b） 采用有機(jī)溶劑（丙酮、氯仿和甲苯） 處理木醋桿菌細(xì)胞，當(dāng)添加量為0.05%時(shí)，對(duì)BC的合成均有輕微的促進(jìn)作用。繼續(xù)增加有機(jī)溶劑添加量，特別是毒性較大的氯仿和甲苯，能導(dǎo)致BC和菌體量急劇下降，這說(shuō)明氯仿和甲苯會(huì)對(duì)細(xì)胞造成大的損傷。

c） 采用超聲波清洗機(jī)超聲處理達(dá)到60 s時(shí)，BC產(chǎn)量是對(duì)照組的1.08倍。超聲處理超過(guò)60 s后，BC產(chǎn)量不再增加，鏡檢可看到菌體碎片。這說(shuō)明適度的超聲可以促進(jìn)BC的合成，超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致菌體破碎。

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Effect of cellmembrane permeability on yield of bacteria cellulose produced by acetobacter xylinum

TANG Weihua1*JIA Shiru2

1（Department of Biological Engineering,Tianjin Modern Vocational Technology College,Tianjin 300350，China）

2（Tianjin Industrial Microbiology Key Laboratory,Tianjin 300457，China）

細(xì)菌纖維素（Bacterial cellulose，BC）是由微生物產(chǎn)生的一類純纖維素。采用化學(xué)法（表面活性劑和有機(jī)溶劑）和物理法（超聲波）改變細(xì)胞膜的通透性，旨在提高BC的產(chǎn)量。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)吐溫-80的添加量達(dá)到4.0%（v/v）時(shí)，BC的產(chǎn)量是對(duì)照組的1.23倍；有機(jī)溶劑（丙酮、甲苯和氯仿）對(duì)BC的合成無(wú)明顯的促進(jìn)作用，當(dāng)氯仿和甲苯添加量分別增至3.0%和1.5%時(shí)，菌體量和BC產(chǎn)量均降至0；適度的超聲處理可促進(jìn)BC的合成，當(dāng)超聲處理時(shí)間為60 s時(shí)，BC是對(duì)照組的1.08倍。

木醋桿菌；細(xì)菌纖維素；有機(jī)溶劑；超聲波；吐溫-80

The bacterial cellulose is a kind ofhigh puritycellulose produced bymicroorganism.The permeabilityofcell membrane was changed bychemical method(surface active agent and organic solvent)and physical method(ultrasonic),which was aimed to increase the yield of bacterial cellulose.The results showed that,the yield of bacterial cellulose was 1.23timesofthecontrolgroupastheamountoftween-80 was4%(v/v).Organicsolvents(acetone,tolueneand chloroform)had nosignificant effect on the synthesis ofbacterial cellulose.When the amount ofchloroformand toluene was increased to 3%and 1.5%respectively,the biomass and the yield of bacterial cellulose decreased to 0.Appropriate ultrasound treatment can promote the synthesis ofbacterial cellulose,when the ultrasonic treatment time is 60 s,BCis 1.08 times of thecontrolgroup.

acetobacter xylinum；bacterial cellulose；organic solvent；ultrasonic；tween-80

TS261.1+3

A

1673-6044（2017）01-0013-04

10.3969/j.issn.1673-6044.2017.01.006

*湯衛(wèi)華，女，1979年出生，2009年畢業(yè)于天津科技大學(xué)發(fā)酵工程專業(yè)，教授。

2016-09-01