補腎益腦灸法通過Wnt信號通路影響圍絕經期抑郁癥大鼠海馬神經發生?

鄧 雪，任 路△，冷 雪，張 囡，王 旭

(1. 遼寧中醫藥大學，沈陽 110847； 2. 中國醫科大學藥學院，沈陽 110122)

【針灸研究】

補腎益腦灸法通過Wnt信號通路影響圍絕經期抑郁癥大鼠海馬神經發生?

鄧 雪1，任 路1△，冷 雪1，張 囡2，王 旭1

(1. 遼寧中醫藥大學，沈陽 110847； 2. 中國醫科大學藥學院，沈陽 110122)

目的：基于Wnt信號通路觀察補腎益腦灸法對圍絕經期抑郁癥大鼠海馬神經干細胞分化標記物表達的影響并探討其治療機制。方法： 60只大鼠按隨機數字表法分為空白組、模型組、假手術組、西藥組和艾灸組5組，采用去勢和慢性不可預見刺激結合制備圍絕經期抑郁癥大鼠模型。連續治療28 d，觀察大鼠一般情況變化、動情周期、體質量及糖水消耗實驗結果，運用ELISA法檢測海馬組織中的GFAP、Tuj-1、GSK-3β、β-catenin，RT-PCR法檢測海馬組織中的GSK-3βmRNA、β-catenin mRNA表達。結果：造模后其他組較空白組表現出抑郁行為，而治療后抑郁行為好轉，西藥組、艾灸組及假手術組較模型組海馬組織中GFAP、GSK-3β及GSK-3βmRNA的表達量增加，Tuj-1、β-catenin及β-catenin mRNA表達量有所減少。結論：補腎益腦灸法可以通過調節海馬Wnt通路GSK-3β、β-catenin的表達調控海馬神經干細胞的定向分化，對圍絕經期抑郁癥起到治療作用。

補腎益腦灸法；圍絕經期抑郁癥；GFAP；Tuj-1；GSK-3β；β-catenin

大量國內外臨床流行病學調研發現，女性圍絕經期抑郁癥的發病率遠遠高于其他生命階段[1-2]。“抑郁癥海馬神經元再生障礙”假說的提出，是近年來抑郁癥病因學研究最具突破性的進展之一，該假說認為抑郁癥的發生與神經可塑性失調密切相關[3]?！澳I者主蟄，封藏之本，精之處也”，其藏與干細胞處于休眠狀態相關，只有出現損傷或者刺激時才會被激活，而腎精的激活與腎中陽氣的推動密切相關，圍絕經期抑郁癥大鼠的治療作用體現在大鼠海馬區神經干細胞定向分化的調控方面。為探討神經干細胞定向分化與腎陽推動作用之間的聯系，本實驗擬建立圍絕經期抑郁癥大鼠模型,通過艾灸干預后觀察海馬神經干細胞分化標記物GFAP及Tuj-1表達，觀察神經干細胞分化情況，檢測海馬wnt信號通路關鍵蛋白GSK-3β、β-catenin蛋白及基因的表達，探討補腎益腦灸法對圍絕經期抑郁癥的作用機制。

1 材料

1.1 主要藥品與試劑

10﹪水合氯醛(北京索萊寶股份有限公司),鹽酸氯米帕明片25 mg/片(江蘇恩華藥業股份有限公司生產,生產批號20140104),GFAP、Tuj-1、GSK-3β、β-catenin酶聯免疫試劑盒(ameko購于上海嵐派生物科技有限公司), 反轉錄試劑盒(ProtoScript? II First Strand cDNA Synthesis Kit NEB，#E6560S)，熒光定量PCR試劑盒(Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix,Agilent， #600838)。

1.2 實驗動物

選用SPF級雌性SD大鼠，日齡56～62 d，體質量(200±10) g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供(動物合格證號SCXK(京)2012-0001)。實驗過程中對動物的處置符合《關于善待實驗動物的指導性意見》的規定[4]。

1.3 主要實驗儀器

LEICA DM LS2顯微鏡(德國, Leica公司生產), DFC500數碼成相軟件(德國, Leica公司), 酶標儀(Gnth 52010), 熒光定量PCR儀(Agilent公司)，805-AⅡ型電針治療儀(廣東汕頭市醫用設備廠)。

2 方法

2.1 分組

所有大鼠適應性喂養21 d(遼寧中醫藥大學SPF級動物實驗室), 按隨機數字表法將60只大鼠分為空白組、模型組、假手術組、西藥組、艾灸組每組各12只。

2.2 模型制備

圍絕經期模型的制備[5]：除空白組和假手術組大鼠外均行雙側卵巢摘除術。假手術組麻醉固定后僅進行至拉出卵巢動作并不進行結扎切除，后續手術操作同摘除卵巢組。

抑郁癥模型的制備：對采用P. Willner[6]傳統慢性不可預見性刺激造模改良，除空白組外所有大鼠進行模型制備，造模21 d，刺激包括夾尾(用止血鉗夾住距大鼠尾尖1 cm處1min)、冰水游泳(4 ℃，5min)、熱應激 (45 ℃，5min)、禁食禁水(24 h)、束縛限制行動(1 h)、潮濕墊料并傾斜籠子(24 h)和晝夜顛倒(24 h)共7種。每天隨機選擇1種刺激，每種刺激平均使用3次，2 d之中同一刺激不在相同個體上重復執行共21 d。

2.3 治療方法

空白組、模型組及假手術組大鼠正常飼養，不接受刺激。西藥組：使用鹽酸氯米帕明片，將藥片用研缽研碎后溶于0.9%生理鹽水，按20 mg/kg·d-1用量灌胃[7]，每日1次，連續28 d。艾灸組:穴位定位參照《實驗針灸學》[8],取雙側“腎俞” (位于大鼠背部, 第二腰椎下旁開5 mm之兩旁肋間)，頭頂“百會”(頂骨正中)，雙側“三陰交”(后肢內踝尖直上10 mm)，以上穴區備皮，在穴位上方2～3 cm處進行艾灸(特制直徑約0.6 cm，長12 cm,純艾絨艾條)，每日1次，每次15 min,連續28 d。

2.4 指標檢測

實驗結束時，除去實驗過程中大鼠死亡情況，各組均取用10只大鼠做相應指標的檢測。

2.4.1 動情周期檢測[9]去勢手術結束后休息3 d，在第4、5、6、7、8天逐只進行陰道涂片檢查，以不出現動情期反應(未見成熟脫落細胞)確定卵巢摘除完全為造模成功。

2.4.2 一般情況觀察 抑郁癥模型復制過程中，觀察記錄大鼠一般情況包括飲食飲水、活動度、精神狀態、毛色等。

2.4.3 體質量測定 分別于抑郁癥模型制備開始前、造模后及治療后測定每只大鼠體質量。

2.4.4 糖水偏嗜實驗[10]實驗前，在隔噪音且安靜的房間內訓練動物適應含糖飲水，每籠同時放置2個水瓶，第1個24 h 2瓶均裝有1%蔗糖水，隨后的24 h 1個瓶裝有1%蔗糖水，1個瓶裝純凈水，為避免場所偏愛，蔗糖水瓶的相關位置(左或右)在測試時進行變化。在實驗前或實驗中沒有食物和水的剝奪，進行動物基礎糖水/純水消耗實驗，同時給予每只大鼠事先定量好的2瓶，1瓶1%蔗糖水，1瓶純水，24 h后取走2瓶并稱重，計算動物的總液體消耗、糖水消耗、純水消耗，糖水偏嗜(糖水偏嗜=糖水消耗/總液體消耗×100%)。

2.4.5 GFAP、Tuj-1、GSK-3β、β-catenin檢測 表1顯示，所有動物實驗結束后禁食24 h不禁水，用10%水合氯醛麻醉后打開腹腔，剝離腹主動脈，用負壓取血管迅速吸取血液。剪開大鼠顱骨，將海馬從腦組織中分離出來，海馬組織勻漿后加入離心管中放入高速離心機以3000 r/min離心10 min，吸取上清液，保存在-80℃冰箱中備用。GFAP、Tuj-1、GSK-3β和β-catenin含量的檢測采用酶聯免疫吸附法(ELISA法)，試劑的配制和操作按試劑盒說明書進行。大鼠大腦海馬GSK-3β mRNA、β-catenin mRNA運用熒光定量PCR法檢測。用Trizol提取總RNA，CDNA由NEB試劑公司合成，熒光定量PCR反應條件：95 ℃， 10 min；40×(95 ℃ 20 s；59 ℃ 20 s；72 ℃ 30 s)。

2.5 統計學方法

表1 熒光定量PCR法檢測引物序列

表2 各組大鼠體質量及糖水偏愛

注：與空白組比較：※P<0.05；與模型組比較：△P<0.05；與假手術組比較：#P<0.05

3 結果

3.1 動情周期檢測

圖1 空白組陰道涂片染色(×200)

圖1、2顯示，空白組和假手術組陰道涂片染色結果顯示，動情前期幾乎全部是有核上皮細胞，動情中期全部是角化上皮細胞間或有少量上皮細胞，動情后期有白細胞、角化細胞和核上皮細胞，動情間期有大量白細胞及少量上皮細胞。2組均有周期性動情出現，而模型組等無此周期改變，證明去勢模型成功。

圖2 假手術組陰道涂片染色(×200)

3.2 一般情況觀察

抑郁癥造模結束后，除空白組外大鼠普遍食欲下降，活動度減少，嗜睡倦臥，被毛乏澤蓬松，便質大多稀溏，表情淡漠且反應遲緩。治療后，艾灸組西藥組上述一般情況明顯改善，模型組、假手術組一般情況有所好轉，但觀察仍差于空白組、西藥組和艾灸組。

3.3 體質量及糖水實驗測定

表2顯示，治療前各組大鼠體質量及糖水偏嗜其他各組與空白組比較均有下降(P<0.05)，證明抑郁癥造模成功。治療后艾灸組、西藥組與模型組、假手術組比較均有升高(P<0.05)，證明治療后治療組抑郁情況有所好轉。

3.4 各組大鼠海馬組織ELISA法檢測GSK-3β、β-catenin、GFAP及 Tuj-1，RT- PCR法測定GSK-3βmRNA及β-catenin mRNA

表3顯示， 模型組海馬組織中GFAP、GSK-3β及GSK-3β mRNA 含量較空白組減少(P<0.05)，西藥組、艾灸組、假手術組與模型組比較增加(P<0.05)，艾灸組、西藥組與假手術組比較減少(P<0.05)。Tuj-1、β-catenin及β-catenin mRNA比較模型組較空白組含量增多(P<0.05)，西藥組、艾灸組、假手術組與模型組比較減少(P<0.05)，艾灸組、西藥組與假手術組比較有所增加(P<0.05)。表明治療結束時海馬神經干細胞分化情況有所改變，治療組GFAP含量減少，Tuj-1含量增多，wnt信號通路處于激活狀態。

4 討論

實驗用大鼠預養至77 d齡以上確保大鼠處于性成熟狀態[11]，以卵巢摘除與慢性不可預見性刺激法合并復制圍絕經期抑郁癥動物模型[12]。從實驗結果觀察到，造模后大鼠一般情況、體質量及糖水偏好較空白組明顯減少，合并復制模型在表面效度、結構效度、預測效度上均有優勢[13]。

表3 神經干細胞分化及wnt信號通路相關指標變化

注：與空白組比較：※P<0.05；與模型組比較：△P<0.05；與假手術組比較：#P<0.05

《素問·生氣通天論》曰:“陽氣者，若天與日，失其所，則折壽而不彰。”陽氣的性質向上而積極，抑郁癥則表現出 “三低”和“六無”，以陽氣不足表現在外。關于陽氣虧虛與抑郁癥的探討一向受到重視[14-16]，中醫基礎理論有陰陽互根互用、陰中求陽、陽中求陰的論斷。腎屬五臟位于下焦,藏精、主骨生髓；腦屬奇恒之腑位置最高,為諸陽之會,主認識,一屬陰一屬陽,上下升降互濟,腎精腎水上滋腦髓,腦固攝升提腎氣,相互作用,互生互長。腎虧則腦髓失養,神明清竅失靈,腦神不清則腎不氣化,以致百病從生[17-18]。腎陽虛不能推動腎精上濟腦髓，不能推動腦內神經干細胞分化，腦?？仗搫t出現思維遲緩、意志減退等癥狀。補腎益腦灸法恰是針對這種情況的治療方法。本次實驗選取督脈“百會”、足太陽膀胱經“腎俞”，足太陰脾經“三陰交”為主要治療穴位。督脈“入屬于腦”，膀胱經 “上額, 交巔, 從巔入腦絡”, 本經主治神志病。“頭為諸陽之會”，“百會”開竅醒神，升提一身陽氣，善治郁證[19]。 “腎俞”善滋腎精，臨床治療圍絕經期抑郁癥累計頻次居高[20]，“三陰交”為足之三陰交匯互通之穴，重在滋陰，填補腎精，臨床選穴常用。選用灸補方法進行治療， 擬探討激發腎中陽氣對腎精上濟腦髓及腦內干細胞定向分化的作用及作用機制。

膠質纖維酸性蛋白(GFAP)是星形膠質細胞特有的細胞骨架蛋白，并被認為是星形膠質細胞成熟的標志[21]。經過抗抑郁治療，GFAP的海馬表達與神經發生密切相關[22]。經治療后，治療組GFAP分化程度比模型組增高，這可能是電針治療抑郁癥刺激神經干細胞分化的證據之一。Tuj-1是一種被認為參與神經元細胞類型特異性分化的微管蛋白，抑郁癥領域相關研究也多用Tuj-1的表達監測神經干細胞的增殖及分化水平[23-24]。至于本次試驗結果顯示，Tuj-1在模型組表達最高，這有可能是機體代償性變化的結果。

Wnt信號通路是廣泛存在于真核生物中的一條高度保守的信號通路。β-catenin和GSK-3β是Wnt信號通路的關鍵信號分子[25]。腎中陽氣對干細胞定向分化的推動作用恰與Wnt信號通路對神經干細胞的調控非常相似。有關Wnt信號通路下游分子β-catenin和GSK-3β等在神經干細胞增殖、分化與細胞命運決定等過程中的作用，文獻報道存在較大差異[26-27]。實驗發現，抗抑郁藥物通過抑制 GSK-3β和增加β-catenin蛋白刺激神經發生對抑郁癥起到治療作用[28-29]。有體外實驗發現，隨著神經細胞分化的進行β-catenin表達量逐漸減少，而GSK-3β蛋白表達量逐漸增加，顯示Wnt信號通路由活化狀態逐步走向抑制過程[30]。有研究發現，Wnt信號通路狀態與神經細胞進入定向分化有關[31]。體外實驗研究發現，Wnt信號通路的狀態與GFAP的表達量密切相關[32-33]。

綜上分析，本研究結果表明補腎益腦灸法能誘導海馬神經干細胞定向分化，而這可能與Wnt/β-catenin 通路的激活密切相關。由于 Wnt/β-catenin 信號通路與其他信號通路存在交叉信號，本團隊已在進行相關研究?？傊a腎益腦灸法可以調節wnt信號通路關鍵蛋白GSK-3β、β- catenin及其mRNA的表達水平，對圍絕經期抑郁癥模型大鼠海馬神經干細胞定向分化起到良性調整作用。

[1] 曹書密. 圍絕經期婦女抑郁癥相關因素分析[J]. 中國中醫藥現代遠程教育,2009,11:249-250.

[2] FREEMAN EW, SAMMEL MD, LIN H， et al. Associations of hormonesand menopausal status with depressed mood in women with no history ofdepression[J]. Arch Gen Psychiatry, 2006,63(4):375-382.

[3] DUMAN RS，MALBERQ J，THOME J． Neural plasticity to stress and antidepressant treatment[J]． Biol Psychiatry，1999，46 (9):1181-1191．

[4] 關于善待實驗動物的指導性意見[M].中華人民共和國科學技術部, 2006:9-30.

[5] 石巖,梅世呂.醫學動物實驗實用手冊 [M].北京：中國農業出版社，2002: 95.

[6] P WILLNER,A TOWELL,D SAMPSON, et al.Muscat.Reduction of sucrose preference by chronic unpredictable mild stress, and its restoration by a tricyclic antidepressant[J].Psychopharmacology, 1987,93:358-364.

[7] 徐叔云,卞如濂, 陳修. 藥理實驗方法學[M].2版. 北京: 人民衛生出版社,1982:1535.

[8] 李忠仁.實驗針灸學[M]．北京：中國中醫中藥出版社,2003:147-148.

[9] 郭志偉,郝光,郭宏宇,等. 慢性砷暴露對大鼠動情周期影響[J]. 中國公共衛生,2011,1:85.

[10] 孫合亮,邱麗麗,賈敏,等. 氯胺酮對慢性應激抑郁大鼠行為學及海馬一氧化氮合酶的影響[J].臨床麻醉學雜志,2013,12:1207-1209.

[11] 戴方偉,陳文文,毛棟森,等. SD雌性大鼠性發育早期性器官等臟器和性激素的動態變化[J]. 中國比較醫學雜志,2009,7:33-37.

[12] RéCAMIER-CARBALLO S, ESTRADA-CAMARENA E, REYES R, et al. Synergistic effect of estradiol and fluoxetine in young adult and middle-aged female rats in two models of experimental depression[J]. Behav Brain Res, 2012,233(2):351-358.

[13] 孫靜汾,趙燁,吳素慧. 圍絕經期綜合征實驗動物模型的比較分析[J]. 山西醫科大學學報,2007,1:43-45.

[14] 包祖曉,田青,高新彥. 抑郁癥與陽氣虧虛的相關性探討[J]. 江西中醫藥,2009,40:9-10.

[15] 傅沈康,李丹,任路.再論“郁證”與陽虛的關系[J].中國中醫基礎醫學雜志,2013,19:1388-1389.

[16] 傅沈康,鄧雪,任路.以“調五臟護腎陽”為基礎的圍絕經期抑郁癥研究[J].世界科學技術:中醫藥現代化,2015:2538-2542.

[17] 郭汝寶,蘇云放. 試論中醫腎腦的升降互濟關系[J]. 光明中醫,2008,7:924-925.

[18] 陳雪梅,胡德. 腎腦相關理論溯源與思考[J]. 湖南中醫雜志,2014,5:113-114.

[19] 羅文政,張清仲,賴新生. 解郁調神針刺法治療失眠伴抑郁障礙療效觀察[J]. 中國針灸,2010,11:899-903.

[20] 王洪彬,李曉泓,莫捷,等. 針灸治療女性更年期抑郁癥臨床選穴規律研究[J]. 遼寧中醫雜志,2012,1:136-138.

[21] GOMES F C，PAULIN D，MOURA N V，et al． Glial fibrillary acidicprotein (GFAP): modulation by growth factors and its implicationin astrocyte differentiation[J]． Braz J Med Biol Res，1999，32(5): 619-631．

[22] 趙瑞珍,唐啟盛,趙晶,等. 頤腦解郁方對抑郁模型大鼠腦內GFAP、Bfgf、BDN的影響[J]. 北京中醫藥大學學報,2011，34(12):823-825.

[23] 劉有恒,趙阿勐. 老年抑郁模型大鼠神經可塑性變化及氟西汀的干預機制[J]. 中國老年學雜志,2014，34(4):1002-1003.

[24] 張彤. 老年抑郁模型大鼠神經可塑性變化及溫膽湯的干預機制[J]. 中國老年學雜志,2014:3660-3661.

[25] ZECHNER D,FUJITA Y,HVLSKEN J,et al. beta-Catenin signals regulate cell gror cell expansion and differentiation the nervous system[J].Dev Biol,2003,257(2):406-418.

[26] KLEBER M, LEE HY, WURDAK H, et al. Neural crest stem cell maintenance by combinatorial Wnt and BMP signaling[J]. J Cell Biol, 2005, 169(2): 309-320.

[27] HOLOWACZ T, HUELSKEN J, DUFORT D, et al. Neural stem cells are increased after loss of β-catenin, but neural progenitors undergo cell death[J]. Eur J Neurosci, 2011,33(8): 1366-1375.

[28] ZHU Z, KREMER P, TADMORI I,et al. Lithium suppresses astrogliogenesis by neural stem and progenitor cells by inhibiting STAT3 pathway independently of glycogen synthase kinase 3 beta[J]. PloS one, 2011,6(9):e23341.

[29] WEXLER EM, GESCHWIND DH, PALMER TD. Lithium regulates adult hippocampal progenitor development through canonical Wnt pathway activation[J]. Molecular psychiatry, 2008,13(3):285-292.

[30] 張建,顧茵,羅學勝,等.Wnt信號通路分子在大鼠神經干細胞分化過程中的表達[J].中華老年多器官疾病雜志,2013,(12):932-936.

[31] LANGE C，MIX E，RATEITSCHAK K，et al. Wnt signal pathways and neural stem cell differentiation[J]．Neurodegener Dis，2006，3(1-2)：76-86．

[32] 何丁文,殷明,鄔亞華,等.Wnt/β-catenin信號通路在大鼠BMSCs神經分化中的作用研究[J].中國生物工程雜志,2013,33:61-67.

[33] 郭超,劉潤,趙紅斌,等.Wnt/β-catenin信號通路介導紅景天苷誘導間骨髓充質干細胞向神經細胞定向分化研究[J].中國中西醫結合雜志,2015，25(3):349-354.

MoxibustionInfluenceTheNeurogenesisofHippocampalinOvariectomizedandChronicUnpredictableMildStressRatsViaWnt/Beta-cateninSignalingPathway

DENG Xue1, REN Lu1△, LENG Xue1, ZHANG Nan2, WANG Xu1

(1.LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110847; 2.ChineseMedicalSciencesUniversity,Shenyang110122,China)

Objective: To observe the expression of neural stem cell differentiation markers on Wnt signaling pathway in perimenopausal depressive rat’s hippocampus; to explore the mechanism of moxibustion treatment for nourishing “Kidney - Brain System”.Methods： 60 rats were randomly divided into five groups: a normal group, a model group, a sham operation group, a western medicine group, and a suspended moxibustion(SM) group. A perimenopausal depressive rat’s model was made by castration and chronic unpredictable stress combination. The treatments were for 28 days. The general condition of rats, the rat’s estrous cycle, the weight of rats, and sugar consumption experiment of rats were observed. GFAP, Tuj-1, GSK-3 beta and beta-catenin in rat’s hippocampus tissue were detected by Elisa. RT-PCR method was used to detect the expression of GSK-3βmRNA and β-catenin mRNA in the rat’s hippocampus.Results: After modeling, except the normal group, the depressive behavior of all other groups was showed , however, after treatment，the depressive behavior of rats was dramatically reduced. Compared with the model group, the expression of GSK-3, GSK-3, mRNA and GFAP in the rat’s hippocampus of western medicine group, moxibustion group and sham operation group was increased, Tuj-1, beta -catenin and beta mRNA -catenin expression was reduced. Conclusion: Moxibustion treatment could nourish “Kidney - Brain System” through changing the expression of GSK-3β and β-catenin on Wnt signaling pathway in perimenopausal depressive rat’s hippocampal and through regulating the directional differentiation of neural stem cells in the hippocampus. Moxibustion has effect on the treatment of perimenopausal depression.

Bushen Yinao moxibustion; Perimenopausal depression; GFAP; Tuj-1 GSK-3β; β-catenin

國家自然科學基金資助項目(81373718)-基于“腎腦相濟”理論探討電針誘導腦海馬內源性神經干細胞分化治療圍絕經期抑郁癥的作用;國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)項目(2010CB530401973)-中醫“腎精命火”臟象理論相關疾病與證候的研究;國家自然科學基金資助項目(81503273)-黃連素促進海馬神經發生治療糖尿病腦病認知障礙的機制研究;遼寧省高等學校優秀人才支持計劃項目(LR2014027)-基于“腎腦相濟”理論探討電針對更年期抑郁癥cAMP/PKA-CREB-BDNF信號通路的調節作用;中醫臟象理論及應用國家教育部重點實驗室

鄧 雪(1986-),女,山東淄博人,醫學博士，從事針刺機理的現代研究。

任 路(1966-),女，教授，醫學博士，博士研究生導師，從事針灸治療心身疾病的機制研究，Tel:13700016613,E-mail:inzyxkc@sina.com。

R245.81

B

1006-3250(2017)09-1288-04

2017-03-27