雙親性載體HA—GMS的構建及載胰島素納米乳的評價

樸明貫 左阿龍

摘 要： [目 的]利用酯化反應合成單硬脂酸甘油酯修飾雙親性透明質酸載體（HA-GMS），優化處方制成油包水（W/O）型HA-GMS納米乳，并胰島素為模型藥物研究理化性質，提高胰島素胃腸道穩定性和生物利用度。

[方 法]以單硬脂酸甘油酯（GMS）酯化透明質酸（HA）的羧基合成雙親性化合物HA-GMS，以納米乳相區面積為考察指標，對制備空白納米乳的油相，內水相pH進行優化，加制備HA-GMS，研究濃度對空白納米乳的影響；制備W/O型HA-GMS胰島素納米乳，進行理化性質的考察和酶降解實驗，并以大鼠為實驗動物，對胰島素納米乳的降糖效果進行考察。

[結 果]實驗結果表明，透明質酸的羧基和單硬脂酸甘油酯的羥基酯化成功。HA-GMS的胰島素納米乳的載水量達到6%左右，平均粒徑為33.9nm，通過透射電鏡顯示胰島素納米乳為圓整的球形或橢圓形，大小較均勻。胰島素納米乳酶降解實驗中，90分鐘時胰島素剩余百分比分別為21%和37%，顯著提高胰島素的胃腸道穩定性。藥效學研究表明口服胰島素納米乳有一定降糖作用，灌胃4小時大鼠血糖含量達到初始值的70.28%，作用效果達到12小時左右。

[結論]HA-GMS納米乳給藥系統能顯著增加胰島素在胃腸道中的穩定性，在大鼠體內顯著增加胰島素的生物利用度，并延長胰島素降糖作用時間。

關鍵詞： 透明質酸，胰島素，W/O納米乳

【中圖分類號】 R94 【文獻標識碼】 A【文章編號】 2236-1879（2017）20-0297-02

多肽類藥物口服給藥面臨的問題是胃腸道環境的影響和腸道粘膜的低通透性，口服首先被胃蛋白酶水解，后進入腸道，遭各種蛋白酶的降解致多肽類藥物口服生物利用度降低。對蛋白質類藥物結構進行化學修飾，能增加脂溶性，提高膜滲透性和抵抗酶分解能力，但修飾后的前藥生物活性往往降低，體內代謝動力學性質也會因一級結構的改變發生變化，產生新分子實體的安全性評價也是長期過程[1]。研究結果顯示，多肽類口服生物利用達到上限，有必要探索新口服吸收方法及藥物傳遞系統。

納米乳是表面活性劑分子在油水界面上，疏水端伸向油相，親水端伸向水相自發形成有穩定結構的劑型[2]，油包水（W/O）型微納米乳一直作為制備蛋白質類藥物的給藥系統[25]。有效使用多種生物可降解材料及具有生物相容性的材料為藥物的載體，使藥物與相應的載體材料形成尺度在納米級的給藥系統。這種新型的納米藥物傳遞系統由于其結構能對藥物進行有效的包裹，口服能對藥物在胃腸道中具有一定的保護作用[3]，較小粒徑也增加在胃腸道中的比表面積，從而增加吸收面積[4]，新功能性載體材料的應用，也能改善制劑在胃腸道中的吸收和保護作用[6]。

透明質酸是在細胞外基質、結締組織和高等動物的器官中廣泛分布天然蛋白多糖[7]。將采用透明質酸合成單硬脂酸甘油酯酯化的HA-GMS雙親性化合物，制備W/O型HA-GMS載胰島素納米乳，W/O型HA-GMS納米乳對蛋白質類藥物的保護作用。

1.材料與儀器

材料。

透明質酸；磷酸二氫鈉；磷酸氫二鈉，丙酮；透析袋；碳二亞胺鹽酸鹽；N-羥基琥珀酰亞胺；單硬脂酸甘油酯；吐溫80；司盤80；乙醇；肉豆蔻酸異丙酯；中鏈甘油三酯；大豆油；胰島素；磷酸緩沖液；硫酸鈉；乙腈；四氧嘧啶；SPF級，Wistar鼠，體重240-260g，雄性。

1.1儀器。

磁力攪拌器；超速冷凍離心機；冷凍干燥機（Virtis BT2k，SP SCIENTIFIC）；超聲清洗器；實驗室pH計（STARTER 2100）；漩渦儀（West Thorndale Ave）；電子天平（BSA2201）；核磁共振儀（AV-300，）；傅里葉紅外光譜測定儀；血糖儀（SURESTEP PLUS）；JL-1197型激光粒度分布測試儀；HP1100高效液相色譜儀；日本JEM-1200EX透射電鏡。

2.方法與結果

2.1HA-GMS納米口服給藥系統的制備和優化。

2.1.1HA—GMS的合成與表征。

對HA的羧基進行共價修飾，在羧基上連接疏水性基團GMS，增加HA的疏水性。首先把HA和EDC/NHS分別溶解在PBS（pH為7.4），攪拌2h，將溶液滴入GMS丙酮溶液中，反應24h，將得到的混合物在15000rpm，4℃下離心20min/次，直到不渾濁，將上清液用透析膜透析3天[9]，冷凍干燥得到樣品粉末，用紅外光譜和核磁共振氫譜表征結果如圖1和圖2。

在圖1中，3466cm-1左右為HA的-OH基團，1800-1600為C=O，1260-1000為C-O單鍵，在2922.16附近產生伸縮振動，1400-1500的伸縮為sp3，sp2的C-H，經酯化引入碳水化合物鏈，HA-GMS比HA所有吸收都尖銳，驗證GMS單體連接新HA鏈。圖2，HA-GMS在1ppm左右出現的峰進一步證明HA連接含H基團。透明質酸的羧基和單硬脂酸甘油酯的羥基化成功。

2.2.2納米乳的制備和優化。

選擇常見油相，表面活性劑，助表面活性劑混合后，滴水相，超聲分散5min，采用單因分析法分別考察納米乳的最佳油相，最適HLB值，應用軟件Origin8繪制偽三相圖，用AutoCAD計算處方相圖中納米乳面積考察空白處方，選擇納米乳相區面積較大的處方對水相pH進行考察，為后續載胰島素篩選最佳酸性水相[10]。

IPM在HLB=5，7的時候有較大的納米乳相區面積，分別為5.73%和3.38%。選擇IPM為油相在HLB值為5-8之間進行進一步篩選。HLB=9時，各納米乳相區均較小，HLB值較小時傾向形成油包水體系，較大時更傾向形成水包油體系，選擇三種在納米乳中安全性較高的三種油相，分子體積大小排列為MCT

HLB=5，Km=2和HLB=8，Km=4時均有較大的納米乳相區面積，分別為4.58%和4.42%。Km=2時，納米乳相區的面積隨著HLB值增大而減小，不符合HLB理論。Km=3時，隨著HLB值的增大，納米乳相區無顯著變化，Km=4時，納米乳相區有增大的趨勢。據不同Km值和HLB值得到的納米乳相區面積，綜合考慮存放過程中，發現HLB=8，Km=4時雖有較大的納米乳相區面積，但納米乳會產生分層現象，綜合考慮制劑的載水量，選擇載水分別為5.75%，4.95%，3.28%的三個處方進一步考察，處方組成如表1。

圖5看出，在1號和2號處方中，內水相pH等于2，有較大的載水量，處方3中，pH對載水量幾乎無影響，可能是因為處方3中，載水量較少，pH對載水量的影響不顯著，在空白納米乳載親水性藥物時，在不影響藥物穩定性前提下，內水相pH為2時有較大載藥量。

2.2.3HA-GMS納米乳的制備和優化。

制備的理論可以提高油水界面的穩定性的HA-GMS為兩親性材料，選擇載水量較高的處方，在空白納米乳中加入不同濃度的HA-GMS，測載水量變化，研究HA-GMS對納米乳制劑穩定影響。

測定結果可看出，HA-GMS在0.5-12mg/ml時載水量無顯著變化，濃度大于12mg/ml時，載水量急劇下降。制備過程發現，納米乳制備一定時間，未加入HA-GMS的納米乳分層現象明顯，HA-GMS能提高納米乳的穩定性。

2.2HA-GMS胰島素納米乳口服載藥系統的評價和酶降解實驗。

2.2.1胰島素納米乳的粒徑和形態。

選擇載水量較高的處方1，加胰島素，用負染色法制備樣品：取胰島素納米乳適量，取1-2滴于銅網上，靜一段時間，自然晾干，滴2%磷鎢酸溶液，負染3min，自然揮干。透射電子顯微鏡下觀察形態，拍照，多分散激光粒度儀測量粒徑大小，結果如圖7，圖8所示。

制得胰島素納米乳為球形或橢圓形，大小較均勻。因測前存放時間較長，有一定聚集現象。圖8粒徑分布看出，粒徑分布較窄，大小分布均勻，平均粒徑為33.9nm，較小粒徑使乳滴不易發生聚集，利保持胰島素納米乳的穩定性。

2.2.2 HA-GMS胰島素納米乳體外酶降解實驗。

依最優處方制備胰島素納米乳，用0.01mol/L鹽酸配置相同藥物含量的胰島素溶液，分別加入到配置好的人工胃液，37℃孵化，在0，3，6，9，15，30，60，90min應用反透析法在透析袋內取樣200μL，高效液相色譜法測定胰島素含量，色譜柱：美國Thermo Hypersil GOLD C18柱，流動相為0.1mol/L磷酸二氫鈉-0.1mol/L硫酸鈉-乙腈，用磷酸調節pH為3.0；流速為1.0ml/min；紫外檢測波長為214nm；進樣量為20μL，柱溫為30℃[11]。計算胰島素的剩余率。

在胃蛋白酶中，胰島素原料藥18min左右即降解完全，在胃液中，90min剩余百分含量約為21%。在胰蛋白酶的降解下，胰島素90min降解量約為96%，胰島素制劑在胰蛋白酶的降解下90min剩余百分含量約為37%。結果顯示，胃蛋白酶對胰島素制劑的降解效果較強，納米乳制劑均對胰島素有一定的保護作用。

2.3口服HA-GMS胰島素納米乳的大鼠體內降血糖實驗。

取鼠15只，飼養3天，禁食12時，照150mg/kg腹腔注射四氧嘧啶，在充足日光照射下飼養5天，造模5天，禁食12時，尾靜脈取血，照血糖儀說明方法測定大鼠空腹血糖濃度，血糖濃度大于11mmol/L為造模成功[12]。

取糖尿病鼠12只，隨機分4組，每組3只，分別為載藥納米乳組，原料藥組，空白納米乳組，對照組，載藥納米乳組和原料藥組給藥相當原料藥20IU/kg，實驗過程禁食，自由飲水，于0，1，2，3，4，6，8，10，12h尾靜脈取血，血糖儀測定血糖值，算各時間血糖濃度占初始血糖濃度百分比，繪制血糖曲線。

原料藥組，空白納米乳組與對照組對比均無顯著差異，說明納米乳輔料對血糖值無顯著影響，胰島素納米乳制劑組與其他組相比，降糖效果顯著，降糖效果持久。原料藥組與載藥納米乳組對比，證明表面活性劑和油相共同包裹的胰島素有效避免胃腸道中胃蛋白酶水解，使胰島素不受胃腸道中環境的影響。制備W/O型納米乳可以有效促進胰島素口服吸收。

3.討論

原料藥組與載藥納米乳組對比，證明雙親性載體HA-GMS構建納米乳有效避免胰島素在胃腸道中被胃蛋白酶水解，納米乳內水相給胰島素提供穩定的環境，胰島素不受胃腸道中環境的影響。

參考文獻

[1] 崔福德，石凱，寸冬梅.蛋白多肽類藥物納米粒口服給藥系統的研究進展[J].沈陽藥科大學學報，2010，27（12）：946-951.

[2] Schick M J.Reverse micelles，edited by P. L.Luisi and B.E.Straub，Plenum，New York，1984，354 pp.Price：$55.00[J].Journal of Polymer Science Polymer Letters Edition，1985，23（3）：163-164.

[3] 梅建生.口服胰島素納米載體的研究進展[J].中華實用醫藥雜志，2004.

[4] 姜偉明，郭圣榮.載體材料在改善納米粒腸道吸收研究中的應用[J].南京中醫藥大學學報，2013，29（3）：297-300.