潔凈室沉降菌監(jiān)測影響因素分析

廖波 吳永智 肖莉

[摘要] 目的 對潔凈室沉降菌監(jiān)測中可能影響微生物生長的各種因素進行試驗分析，找出一種行之有效的操作方法。方法 按《中國藥典》2015年版四部9205要求對潔凈室沉降菌進行監(jiān)測。結(jié)果 培養(yǎng)方式、培養(yǎng)基的量、沉降碟暴露時間、沉降碟放置位置對最終監(jiān)測結(jié)果均有一定影響。結(jié)論 對潔凈室進行沉降菌監(jiān)測時應綜合考慮各種因素的影響，以得到最客觀的監(jiān)測結(jié)果。

[關(guān)鍵詞] 潔凈室；沉降菌；影響因素

[中圖分類號] R155.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1672-5654（2017）06（b）-0045-04

藥品潔凈實驗室應定期進行微生物檢測，內(nèi)容包括非生物活性的空氣懸浮粒子數(shù)和有生物活性微生物監(jiān)測，其中微生物監(jiān)測包括環(huán)境浮游菌和沉降菌監(jiān)測[1]。沉降菌監(jiān)測不需要特殊儀器設(shè)備，方便、簡單，可操作性強，是實驗室和生產(chǎn)廠家采用得最多的方法。沉降菌監(jiān)測照《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）沉降菌的測試方法》的現(xiàn)行國家標準進行[2]。微生物檢測結(jié)果的可靠性在很大程度還依賴于操作者的技術(shù)及掌握熟練程度。因此，按系統(tǒng)控制風險的原理，在充分控制好各環(huán)節(jié)操作的前提下，培養(yǎng)基的制備就突出為影響檢測結(jié)果的重要因素。目前市售的成品培養(yǎng)基基本用量在16 mL左右，培養(yǎng)時間大于3 d時普遍存在失水情況，影響檢測結(jié)果的真實可信度。實驗室用培養(yǎng)基多為自配使用的原因也正在于此，但據(jù)觀察發(fā)現(xiàn)，因受實驗室條件的限制，實驗室人員在自制培養(yǎng)基時的隨意較大，體現(xiàn)在取粉量和加水量的多少、還有加熱時間和加熱溫度的不確定性、使用量的不均勻等影響因素。該文也是基于對自制培養(yǎng)基過程中風險因素的可控考慮，從配制用水所致的含水量高低、注入皿內(nèi)培養(yǎng)基的基體用量等對培養(yǎng)生檢測結(jié)果有影響的因素出發(fā)，以驗證控制培養(yǎng)基配制條件的必要性。

1 儀器、設(shè)備與材料

1.1 儀器

全自動數(shù)顯恒溫鼓風干燥箱（GZX-9246MBE）；全自動數(shù)顯生化培養(yǎng)箱（SPX-250B-Z）；全自動數(shù)顯立式蒸汽滅菌器（YXQ.SJ41.280）；生物安全柜（BHC-1300ⅡA2型）；滅菌刻度吸管、試管、Q 90 mm×15 mm培養(yǎng)皿等。

1.2 設(shè)備

標準潔凈室，T：18～26℃，RH：45%～65%。

1.3 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，批號20160121；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，批號20160208；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，批號20160118；沙氏葡萄糖瓊液體養(yǎng)基，批號20160302）。所有制備好的培養(yǎng)基均照《中國藥典》2015年版（四部）1421“滅菌法”[1]操作，在121℃滅菌20 min。

1.4 驗證試驗用菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）（10104）]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）（63501）]、白色念珠菌[CMCC（F）（98001）]、黑曲霉菌[CMCC（F）（98003）]（貴州省食品藥品檢驗所）。所有實驗用菌種均為第三代。

2 方法

2.1 菌液制備

取經(jīng)30～35℃培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌與枯草芽孢桿菌的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物1 mL分別加至9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋成相應濃度且含菌數(shù)小于100 cfu/mL的菌懸液備用。

取經(jīng)20～25℃培養(yǎng)2～3 d的白色念珠菌的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物1 mL ，加入9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至相應濃度且含菌數(shù)小于100 cfu/mL 的菌懸液備用。

取經(jīng)20～25℃培養(yǎng)5～7 d的黑曲霉菌的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)物，加2 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，洗下孢子，轉(zhuǎn)移至另一空管，取1 mL 加至9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋成相應濃度且含孢子數(shù)小于100 cfu/mL 的孢子懸液備用。菌液計數(shù)結(jié)果見表1。

2.2 方法驗證

培養(yǎng)基適用性檢查：每次均以兩個平皿在操作臺暴露4 h作為陰性對照。比值計算公式：

2.2.1培養(yǎng)基失重情況考察（單位：g） ①取制備好的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基沉降碟（培養(yǎng)基量30 mL）先在30～35℃常規(guī)預培養(yǎng)48 h后在潔凈室動態(tài)環(huán)境下暴露4 h，再依法培養(yǎng)。結(jié)果見表2。

②取制備好的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基沉降碟（培養(yǎng)基量30 mL）以雙層透明無菌袋包裝燙封后先在30～35℃預培養(yǎng)48 h后，在潔凈室動態(tài)環(huán)境下暴露4 h，再依法培養(yǎng)。結(jié)果見表3。

2.2.2培養(yǎng)基量對微生物生長的影響 依法制備胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基沉降碟45個（培養(yǎng)基加入量分別為：20、30、40 mL各15個），以雙層透明無菌袋包裝燙封后在30～35℃培養(yǎng)48 h，無菌生長。在潔凈室操作臺均勻放置，動態(tài)暴露4 h后，取不同培養(yǎng)基量的沉降碟分為5組分別接種。接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌菌液的，于30～35℃培養(yǎng)2 d；接種白色念珠菌、黑曲霉菌液的，于20～25℃培養(yǎng)5 d。點計菌落數(shù)，取平均值計算比值。結(jié)果見表4。

2.2.3暴露時間對微生物生長的影響 依法制備胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基沉降碟60個（培養(yǎng)基加入量30 mL）以雙層透明無菌袋包裝燙封后在30～35℃培養(yǎng)48 h，無菌生長。分成4組，每組15個，在潔凈室操作臺均勻放置，動態(tài)暴露時間分布為1、2、3、4 h，取不同暴露時間的沉降碟分為5組分別接種。接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌菌液的，于30～35℃培養(yǎng)2 d；接種白色念珠菌、黑曲霉菌菌液的，于20～25℃培養(yǎng)5 d。點計菌落數(shù)，取平均值計算比值。結(jié)果見表5。

2.2.4培養(yǎng)方式對微生物生長的影響 ①培養(yǎng)方式1：常規(guī)培養(yǎng)。依法制備胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基沉降碟15個（培養(yǎng)基加入量30 mL）以雙層透明無菌袋包裝燙封后在30～35℃培養(yǎng)48 h，無菌生長。在潔凈室操作臺均勻放置，動態(tài)暴露4 h后，分為5組分別接種。接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌菌液的，于30～35℃培養(yǎng)2 d；接種白色念珠菌、黑曲霉菌菌液的，于20～25℃培養(yǎng)5 d。點計菌落數(shù)，取平均值計算比值。結(jié)果見表6。

②培養(yǎng)方式2：密封培養(yǎng)。如①操作，以雙層透明無菌袋包裝燙封后續(xù)培養(yǎng)，結(jié)果見表6。

③培養(yǎng)方式3：加濕培養(yǎng)。如①操作，續(xù)培養(yǎng)期間于培養(yǎng)箱拖水盤中加入適量水或在培養(yǎng)箱中放入裝水的燒杯，每天檢查水量并及時補充，點計菌落數(shù)，取平均值計算比值。結(jié)果見表6。

3 討論

3.1 培養(yǎng)基失重情況考察

因為采用的沉降碟不是終端滅菌，制備好后要100%進行預培養(yǎng)。常規(guī)預培養(yǎng)后依法操作，培養(yǎng)基總失重平均占比情況（失重率%）結(jié)果如表7。

說明采用密封預培養(yǎng)能明顯減少預培養(yǎng)過程中的水分損失，同時在沉降菌監(jiān)測中沉降碟不應放置于通風口附近。因為不同潔凈室或生產(chǎn)車間環(huán)境條件不一樣，受溫度濕度及層流的風速的影響，培養(yǎng)基失重數(shù)據(jù)會有一定波動。

3.2 培養(yǎng)基量干擾培養(yǎng)結(jié)果

培養(yǎng)基為20、30、40 mL驗證測得比值均在0.5～2范圍內(nèi)。但培養(yǎng)基量以30～40 mL為宜；20 mL量較少，水份損失后對微生物生長有一定影響，例如銅綠假單胞菌，比值僅為0.59；實際操作時不可能采用量器加培養(yǎng)基，加量不會很精準，多于40 mL已接近培養(yǎng)皿上沿，操作不當可能導致培養(yǎng)基溢出，同時黑曲霉培養(yǎng)5 d后已生成較為豐富的菌絲，如接觸皿蓋，造成計數(shù)困難，且孢子一旦逸出則會導致嚴重的環(huán)境污染。

3.3 通風口附近不宜放置沉降碟

培養(yǎng)時間在1～4 h之間各菌驗證測得比值均在0.5～2之間，且同一種菌4個時間段的比值無顯著性差異。說明采用密封預培養(yǎng)、高澆注培養(yǎng)基及避免在通風口附近放置沉降碟后，單向氣流暴露4 h的水分損失不足以影響微生物的生長。

3.4 合理選擇需氧或厭氧培養(yǎng)條件

對于許多需氧微生物而言，氧氣是其呼吸作用的最終電子受體，對其生長至關(guān)重要[3]。在方式2的培養(yǎng)中，銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉都是需氧菌，尤其是枯草芽孢桿菌在其生長過程中能迅速消耗環(huán)境中的游離氧，形成厭氧環(huán)境，使復蘇遲緩的個體無法生長，故驗證測得比值均低于0.5。只有金黃色葡萄球菌是需氧或兼性厭氧菌，在缺氧的環(huán)境中仍能維持驗證測得比值在0.5～2范圍內(nèi)。

3.5 培養(yǎng)基含水量直接影響檢出效率

水是所有生命形式都無法或缺的。水的可利用度是由材料或液體中的水活度來反映的（水活度為在同等溫度和壓力下，某種材料上方空間內(nèi)的水蒸氣與純水上方空間內(nèi)的水蒸氣的壓力之比）。革蘭氏陰性菌不能在水活度低于0.97的環(huán)境中生長，而革蘭氏陽性菌則可以在水活度0.8～0.98的環(huán)境中生長。在方式3的培養(yǎng)中，因為提高了培養(yǎng)環(huán)境的相對濕度（從34%提高到66%），有效地降低了培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中的水分損失，從而提高了培養(yǎng)環(huán)境中的水活度，有利于微生物的生長，所有對照菌的驗證測得菌數(shù)均有明顯的提高，比值均提高到0.8以上。建議有條件的實驗室在檢測對象系對水含量敏感的菌類時，盡量在可調(diào)節(jié)和濕度的專業(yè)培養(yǎng)設(shè)備中完成培養(yǎng)，提高檢出效率。

3.6 兼顧沉降碟采樣時間與工作效能的平衡

考慮到單向氣流暴露4 h，培養(yǎng)基水分損失后是否會影響微生物的生長，藥典和GMP提出“單個沉降碟的暴露時間可以少于4 h，同一位置可使用多個沉降碟連續(xù)進行檢測并累計計數(shù)”的方法，這一方法不適應于生產(chǎn)企業(yè)，非無菌產(chǎn)品和無菌產(chǎn)品的生產(chǎn)車間需控制面積大，采用累積計數(shù)法，沉降碟成倍增加，極大增加了工作量。

綜上所述，密封預培養(yǎng)、高澆注培養(yǎng)基、遠離通風口放置、加濕續(xù)培養(yǎng)的聯(lián)合運用，既能滿足《中國藥典》2015年版和《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）沉降菌的測試方法》對潔凈室沉降菌監(jiān)測的要求，又能使監(jiān)測結(jié)果科學、客觀、可靠。

[參考文獻]

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2] GB/T 16294-2010.醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）沉降菌的測試方法[S].北京：中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局、中國國家標準化管理委員會，2010.

[3] [英]S.P.德尼爾，等.藥物微生物學[M].北京：化學工業(yè)出版社，2007：40，46.

（收稿日期：2017-03-13）