加味五子衍宗丸神經保護作用靶點群的鑒定與功能分析

曾克武+萬彥軍+廖理曦+姜昆+王學美+劉蓮英+屠鵬飛

[摘要] 中藥復雜體系的作用靶點群鑒定是中藥藥理機制研究的關鍵。該研究構建了一種表面鍵合有光敏二苯甲酮基團的磁性微球，利用紫外光激發下二苯甲酮基團活化并與中藥化學成分中的碳氫鍵發生共價鍵合的特性，將中藥加味五子衍宗丸的化學成分組鍵合到磁性微球表面，并與神經細胞裂解液共孵育，進而富集加味五子衍宗丸對應的神經保護靶點群。針對靶點群進行蛋白質組學分析，共發現32個潛在結合靶點。KEGG分析發現這些靶點主要與Hippo和Cell cycle信號通路關系密切，提示加味五子衍宗丸可能參與調控神經干細胞增殖和促進神經細胞分化。該研究從靶點源頭上解釋了加味五子衍宗丸發揮抗癡呆和神經保護作用的潛在藥理機制，進而也提供了一種用于解析中藥復雜成分體系作用靶點群的研究方法，可為今后中藥方劑藥理機制的科學詮釋提供重要的方法學借鑒與參考。

[關鍵詞] 靶點鑒定； 加味五子衍宗丸； 神經保護； 靶點群； 作用機制

[Abstract] Targets group identification in complex Chinese medicine system is a key step for revealing the potential mechanism of Chinese medicine. The solid beads with magnetic core and benzophenone-modified surface were made in our study， and then benzophenone was activated and cross-linked with the C-H bonds of chemical compositions in Chinese medicines under UV excitation. Thus the chemical compositions of modified Wuzi Yanzong pill（MWP） were linked to the solid bead surface， and enriched the neuroprotective targets group of MWP after being co-incubated with nerve cell lysate. We performed proteomics analysis on these targets and discovereda total of 32 potential binding targets. KEGG analysis revealed that these targets were mainly associated with Hippo and Cell cycle signaling pathways， suggesting that MWP might be involved in regulating the proliferation and differentiation of neural stem cells. Our findings elucidate the potential targets and mechanism of MWP on anti-dementia and neuroprotection， and further providean approach for investigating the targets group in complex Chinese medicine system. This novel method may provide methodological references for exploring the pharmacological mechanism of Chinese medicinal formulae in the future.

[Key words] target identification； modified Wuzi Yanzong pill； neuroprotection； targets group； mechanism

靶點是藥物分子發揮疾病治療作用的關鍵生物學基礎，因此藥物靶點的闡明對于揭示藥物作用機制至關重要。中藥具有多成分、多靶點的作用特點，尋找合適方法探究中藥復雜體系的作用靶點群，不僅有利于理解中藥的獨特作用機制，而且還可從中找到一些全新的作用靶點，進而為今后基于靶點的創新藥物設計提供重要技術參考^[1-2]。

加味五子衍宗丸是在古方五子衍宗丸的基礎上加味淫羊藿而成的中藥方劑，主要包含菟絲子、枸杞子、五味子、覆盆子、車前子和淫羊藿，在臨床上對治療老年癡呆以及早期輕度認知障礙有確切療效^[3-4]。但是其成分復雜、作用靶點繁多，對其發揮神經保護作用的分子機制一直未能進行深入闡明。本研究試圖制備一種表面修飾有光敏二苯甲酮基團的磁性微球，通過光活化反應將加味五子衍宗丸的化學成分組鍵合到微球表面，進而與神經細胞裂解液混合孵育，富集相應的靶點群并進行高分辨質譜鑒定。通過對靶點群中每個靶點的生物學功能解析，闡釋了加味五子衍宗丸神經保護作用的分子機制。本研究不僅為加味五子衍宗丸的抗癡呆藥理機制研究提供了一種全新的研究思路，而且對今后其他同類中藥或復雜方劑體系的作用機制研究也具有重要的借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 藥材 加味五子衍宗丸各單味藥材：枸杞子、菟絲子、覆盆子、五味子、車前子、淫羊藿購自北京同仁堂有限責任公司。各藥材按質量比8∶8∶4∶1∶2∶8混合，并用10倍量超純水煮沸提取2次，每次提取時間為1 h。將提取液混合后低溫冷凍干燥成粉末，備用。

1.2 試劑 SHSY5Y神經膠質細胞系購自中國醫學科學院細胞中心，DMEM培養基購自Macgene公司，胎牛血清購自PAN Biotech公司。endprint

1.3 儀器 冷凍干燥機（FDU-1100，Eyela，日本）；微量紫外分光光度計（ND-1000，NanoDrop公司，美國）；Sunrise-Basic酶標儀（TECAN公司）。

1.4 細胞培養與處理 SHSY5Y神經膠質細胞系用高糖DMEM培養基（含10%胎牛血清，100 U·L-1青霉素，100 μg·L-1鏈霉素）進行傳代培養，每2 d傳代1次。收集1×107左右的細胞，加入細胞裂解液（Tris，pH 7.4，150 mmol·L-1 NaCl，1% NP-40，cocktail蛋白酶抑制劑）后，冰浴30 min，然后在4 ℃下12 000 r·min-1離心20 min，取上清液并保存。

1.5 磁性光敏微球的制備 采用共沉淀法制備Fe3O4納米粒子：將FeSO4·7H2O（0.35 g），FeCl3·6H2O（0.32 g），HS-PEG1k-SH（0.1 g，按文獻方法自制^[5]）及30 mL去離子水加入100 mL三口燒瓶中；攪拌、通N2，溫度升至70 ℃；30 min后，迅速加入4 mL的NH3·H2O（25%），繼續反應2 h；用磁鐵分離所得Fe3O4納米粒子（Fe3O4-PEG1k-SH NPs），分別用去離子水、甲醇洗滌至少3次，然后分散于少量甲醇中備用。

在100 mL三口燒瓶中加入Fe3O4-PEG1k-SH NPs（0.05 g），丙烯酰氧基二苯甲酮（ABP，0.01 g，按文獻方法自制^[6]），三乙胺（TEA，30 μL）和20 mL丙酮，通N2、室溫、攪拌反應3 h，所得磁性粒子（Fe3O4-PEG1k-BP NPs）分別用丙酮、甲醇洗滌至少3次，然后分散于少量甲醇中備用。

1.6 磁性微球表面鍵合中藥化學成分 在一帶磨口、平面石英蓋的直管光照反應瓶中，加入Fe3O4-PEG1k-BP NPs（0.01 g），加味五子衍宗丸（0.01g）及20 mL去離子水，通N2 30 min后置于UV光下（375 W汞燈，光強12.5 W·m-2，λ=254 nm）反應1 h，用磁鐵分離所得磁性粒子，并用去離子水洗滌至少3次。然后采用紅外光譜法比較微球在鍵合加味五子衍宗丸前后光譜變化，結果發現利用微球表面BP光敏基團鍵合加味五子衍宗丸后，3 440 cm-1處羥基吸收峰變的尖銳，說明鍵合加味五子衍宗丸化學組分后粒子表面羥基形成氫鍵締合；此外，紅外譜圖中明顯呈現出加味五子衍宗丸化學組分在1 620 cm-1處的特征吸收峰，也表明微球表面成功鍵合了中藥分子。

1.7 靶點群的富集與鑒定 將表面鍵合加味五子衍宗丸化學成分組的磁性微球與SHSY5Y神經膠質細胞裂解液混合后，于4 ℃下孵育12 h，以充分捕獲靶點蛋白。然后用洗脫液（Tris，pH 7.4，150 mmol·L-1NaCl，1% TritonX100，cocktail蛋白酶抑制劑）反復清洗微球6遍，并加入200 μL的loading buffer（2×），煮沸5 min。然后5 000 r·min-1離心2 min，取上清液并進行SDS-PAGE凝膠電泳。銀染后對捕獲的靶點蛋白條帶進行顯影，并對所有蛋白條帶進行酶解和高分辨質譜鑒定，進而確定每個靶點蛋白的屬性及名稱。

1.8 作用靶點群的KEGG通路分析^[7]利用DAVID 6.7（https：//david-d.ncifcrf.gov/）在線分析工具對全部靶點蛋白進行 KEGG 路徑分析，在Upload框架中粘貼所有靶點蛋白對應的基因ID。選擇P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 加味五子衍宗丸神經保護作用靶點群的富集與鑒定 對富集所得靶點蛋白進行凝膠電泳、銀染，共發現16條主要蛋白條帶。對每個蛋白條帶分別酶解后，進行LC-MS-MS高分辨質譜鑒定，共計發現32個潛在結合靶點蛋白（圖1）。因此推測：加味五子衍宗丸的作用靶點群可能主要包括這32個靶點。此外，選取了其中的5個關鍵靶點蛋白（14-3-3zeta，CDK1，Hsc70，Hsp70，Prxd1），并采用Western blot法進行了驗證，結果發現這些蛋白均能夠被加味五子衍宗丸微球所特異性富集。

2.2 加味五子衍宗丸作用靶點群的分類與功能解析 根據鑒定所得靶點群，按照不同蛋白功能進行分類，主要可分為如下10類功能靶點蛋白。①細胞能量代謝：主要包括ATP synthase subunit beta，pyruvate kinase；②蛋白質量控制：主要包括heat shock cognate 71 kDa protein（Hsc70），heat shock 70 kDa protein（Hsp70），ATP-dependent Clp protease，ubiquitin thioesterase，vesicle-associated membrane protein-associated protein；③細胞凋亡：主要包括Rho-related GTP-binding protein，14-3-3 protein；④離子通道：主要包括voltage-dependent anion-selective channel，chloride intracellular channel protein；⑤細胞增殖與分化：主要包括eukaryotic translation initiation factor 3，stress-70 protein，stress-induced-phosphoprotein，serine/threonine-protein kinase，cyclin-dependent kinase 1（CDK1）；⑥線粒體功能調控：主要包括78 kDa glucose-regulated protein，calcium-binding mitochondrial carrier protein，hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase，phosphate carrier protein；⑦抗氧化：主要包括catalase，peroxiredoxin-1（Prdx1），pyrroline-5-carboxylate reductase；⑧神經突觸發育：isoform 2 of ATPase family AAA domain-containing protein，Ras-related protein Rap-1A；⑨炎癥與免疫調控：elongation factor 1-alpha；⑩其他：actin，60S acidic ribosomal protein，guanine nucleotide-binding protein。endprint

2.3 加味五子衍宗丸抗癡呆和腦保護作用的機制詮釋 通過生物信息學分析，作者對鑒定得到的32個靶點蛋白進行了研究。KEGG分析發現，這些靶點主要與4條信號通路相關，包括：Hippo signaling pathway，Cell cycle，Biosynthesis of antibiotics和Shigellosis（圖2）。其中，加味五子衍宗丸與Hippo和Cell cycle 2條信號通路的相關性更為密切（P<0.05）。在Hippo信號通路中主要包含chloride intracellular channel 4和ras homolog family member G等靶點。在Cell cycle信號通路中主要包含hydroxyacyl-CoA dehydrogenase，catalase，pyruvate kinase和pyrroline-5-carboxylate reductase等靶點。其中，加味五子衍宗丸對Hippo通路的調控作用可能主要體現在對神經干細胞的調控方面，因為神經干細胞在中樞神經系統疾病中發揮了重要作用，因此推測加味五子衍宗丸的活性成分可能通過促進神經干細胞增殖和誘導神經細胞分化進而起到神經保護和改善神經病理損傷的作用^[8]。此外，加味五子衍宗丸還可能通過作用于Cell cycle信號通路，促進神經前體細胞的周期進程，進而加快神經前體細胞的增殖以及向神經元的分化^[9]。因此，Hippo和Cell cycle通路作為調控神經干細胞增殖和促進神經細胞分化的重要信號級聯反應，在加味五子衍宗丸的抗癡呆和腦保護作用中發揮了重要角色。

3 討論

如何將中藥復雜體系的作用靶點群從細胞中特異性富集出來并進行鑒定是本研究的關鍵。在此制備了一種表面含光敏二苯甲酮基團的磁性微球，二苯甲酮基團在紫外光激發下可以活化為碳自由基，進而與中藥活性分子中的碳氫鍵發生化學鍵合，鑒于中藥活性分子大多具有碳氫鍵，因此利用該法可以實現將中藥復雜體系的化學成分整體鍵合到磁性微球表面，進而用于后續靶點富集的操作。此外，磁性微球在磁力架上可迅速從細胞裂解液中分離，不必反復高速離心，大大簡化了操作程序，更易進行靶點富集實驗。

在對鑒定得到的靶點群進行生物學功能分析后發現：靶點大致可分為10類，包括細胞能量代謝、蛋白質量控制、細胞凋亡、離子通道、細胞增殖與分化、線粒體功能調控、抗氧化、神經突觸發育、炎癥與免疫調控以及其他功能等。細胞能量代謝、線粒體功能調控相關靶點可能主要是改善并增強神經細胞線粒體內的ATP合成，提高線粒體功能，進而為神經細胞提供更多的能量；蛋白質量控制類靶點可能主要參與了清除神經細胞內不正常蛋白（比如β淀粉樣蛋白）的合成；細胞凋亡、細胞增殖與分化類靶點可能是調控神經細胞的存活與凋亡通路，進而增強神經細胞的活力；離子通道、神經突觸發育類靶點可能是要參與了神經信號傳導與通訊，進而增強了神經元的信息傳導功能；抗氧化類靶點主要是清除神經細胞內的氧化自由基，進而使神經細胞免受氧化性損傷；炎癥與免疫調控類靶點可能是通過調控炎癥相關信號通路進而抑制神經炎癥反應，降低神經炎性損傷。此外，通過KEGG通路富集分析發現加味五子衍宗丸可能主要是通過作用于兩大類信號級聯發揮抗癡呆和腦保護作用的，即Hippo和Cell cycle通路。這2個通路均涉及到神經干細胞的增殖與分化進程，因此推測加味五子衍宗丸的核心調控機制可能是靶向與神經干細胞或神經前體細胞，并通過促進神經元新生和定向分化實現抗癡呆和腦保護作用的^[10-11]。綜合來看，加味五子衍宗丸的活性成分可能涉及到多個方面的神經功能調節，這也正好體現了中藥方劑多成分、多靶點的作用特色。

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[責任編輯 張寧寧]endprint