合歡皮總皂苷抗腫瘤作用靶點(diǎn)鑒定與分子機(jī)制解析

錢(qián)薏+韓清華+劉丹+屠鵬飛+曾克武+梁鴻

[摘要] 合歡皮作為常用中藥，臨床常用于治療失眠、焦慮、腫瘤等?，F(xiàn)代藥理中針對(duì)合歡皮總皂苷（TSAJ）抗腫瘤活性多有報(bào)道，但由于單體成分分離困難，藥理機(jī)制難以開(kāi)展。該研究采用MTT法和Hoechst 33258染色法，確認(rèn)了TSAJ對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，構(gòu)建了表面修飾有TSAJ的固相親合微球，利用該固相微球特異性地從人肝癌細(xì)胞裂解液中富集靶點(diǎn)蛋白，再利用高分辨質(zhì)譜對(duì)富集到的靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行鑒定。采用MataboAnalyst 3.0處理數(shù)據(jù)，篩選并確定了Exportin-2，Beta-actin-like protein 2，Myosin-9，Protein transport protein Sec61 subunit beta，Cytochrome c oxidase copper chaperone等5個(gè)靶點(diǎn)蛋白。這些蛋白分別具有調(diào)控細(xì)胞凋亡及細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、運(yùn)動(dòng)等功能，提示TSAJ的抗腫瘤機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤血管生成有關(guān)。綜上所述，該研究利用TSAJ修飾的固相親和微球，特異性富集并鑒定了TSAJ的靶點(diǎn)蛋白，從靶點(diǎn)源頭上解釋了TSAJ抗腫瘤作用機(jī)制，同時(shí)也為中藥復(fù)雜體系的分子藥理機(jī)制研究提供了一種全新的思路。

[關(guān)鍵詞] 合歡總皂苷； 抗腫瘤； 靶點(diǎn)鑒定； 信號(hào)通路； 作用機(jī)制

[Abstract] Dried stem bark from Albizia julibrissin（AJ） is a common traditional Chinese herb with several therapy effects including insomnia， anxiety and anti-tumor. Recently， the anti-tumor effect and mechanism studies of AJ have drawn much attention； however， there are still some troubles in chemical composition separation， which leads to the difficulties in pharmacological research of AJ. In this study， we firstly confirmed the proliferation inhibitory effect of total saponins from AJ（TSAJ）on human hepatocarcinoma（HepG2） cells， and also tested the apoptosis induction effect of TSAJ. Then， we successfully captured the potential target proteins from HepG2 lysates by using TSAJ-modified solid beads， and identified the target proteins by LC-MS/MS. Finally， we confirmed 5 target proteins including Exportin-2， Beta-actin-like protein 2， Myosin-9， Protein transport protein Sec61 subunit beta，and Cytochrome c oxidase copper chaperone， which are responsible forcell apoptosis， proliferation， differentiation andmigration. In summary， our findings elucidate the potential anti-tumor mechanism of TSAJ from the direct target proteins， and provide a new insight for exploring the pharmacological mechanism of traditional Chinese medicine.

[Key words] total saponins from Albizia julibrissin； anti-tumor； target； pathway； mechanism

合歡皮首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是豆科植物合歡Albizia julibrissin Durazz.的干燥樹(shù)皮，具有安神解郁，活血消腫的功效^[1]，常用于心神不安、憂郁失眠、肺癰瘡腫、跌撲傷痛等。現(xiàn)代藥理研究表明，合歡具有鎮(zhèn)靜、抗腫瘤、抗生育，抗菌等多種作用^[2-5]。合歡皮總皂苷（TSAJ）是合歡皮的主要化學(xué)成分^[6]，近年來(lái)對(duì)其抗腫瘤作用多有報(bào)道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TSAJ體內(nèi)體外抗腫瘤效果都十分顯著，體內(nèi)給藥荷瘤小鼠抑瘤率高達(dá)30% [7]。但由于皂苷類單體成分分離困難，合歡皮皂苷的抗腫瘤機(jī)制研究卻鮮有深入報(bào)道。

藥物靶點(diǎn)的闡明是了解藥物作用機(jī)制的重要前提，對(duì)從源頭上揭示藥物的分子機(jī)制具有重要的指導(dǎo)意義^[8]。作者通過(guò)把中藥活性成分與固相親和微球表面進(jìn)行鍵合，利用中藥活性成分作為探針，直接從細(xì)胞中“鉤釣”直接作用靶點(diǎn)，進(jìn)而對(duì)靶點(diǎn)蛋白的生物學(xué)功能進(jìn)行分析并解釋其藥理機(jī)制。在本研究中，作者構(gòu)建了表面修飾TSAJ的固相微球，特異性地富集了人肝癌細(xì)胞裂解液中的靶點(diǎn)蛋白，然后進(jìn)行高分辨質(zhì)譜分析和鑒定，最終采用MataboAnalysis 3.0篩選并確定靶點(diǎn)蛋白。通過(guò)對(duì)靶點(diǎn)蛋白生物學(xué)功能解析，闡釋了TSAJ的潛在分子藥理機(jī)制，為詮釋中藥多成分、多靶點(diǎn)的作用機(jī)制提供了新的思路。endprint

1 材料

1.1 藥物 合歡皮藥材購(gòu)于陜西，經(jīng)北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)系尚明英副教授鑒定為豆科植物合歡的干燥樹(shù)皮。HepG2人肝癌細(xì)胞系購(gòu)自于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心。

1.2 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基（Macgene，中國(guó)）；胎牛血清（PAN Biotech，德國(guó)）；Epoxy-activated SepharoseTM 6B（GE Healthcare，美國(guó)）；溴化噻唑藍(lán)四氮唑（MTT）（Sigma，美國(guó)）；Hoechst 33258染色液（碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）；Sunrise-Basic酶標(biāo)儀（TECAN公司，美國(guó)）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（SANYO，日本）；DXS-3臺(tái)式顯微鏡（上海締倫光學(xué)儀器，中國(guó)）；CIX100顯微鏡（OLYMPUS，日本）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS和100 U·L-1青霉素，100 μg·L-1鏈霉素）進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，保證實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中。

2.2 合歡皮總皂苷的制備 合歡皮（18 kg）經(jīng)粉碎后，依次用8～10倍量95%乙醇（提取3次）和50%乙醇（提取8次）滲漉法提取，合并提取液并減壓回收溶劑至無(wú)醇味，再加適量的去離子水混懸，然后用2～4倍量乙酸乙酯和正丁醇分別萃取4次。用大孔吸附樹(shù)脂（18 L）對(duì)水相（883.5 g）進(jìn)行處理，依次以水，20%，40%，60%，95%乙醇-水進(jìn)行洗脫，根據(jù)TLC和HPLC結(jié)果將其分成3個(gè)組分，將皂苷類的組分3與正丁醇萃取物合并后共1.2 kg樣品拌樣，分2次上樣于硅膠柱（100～200 目），采用二氯甲烷-甲醇-水（100∶0∶0，10∶1∶0.1，5∶1∶0.1，5∶1∶0.1，7∶3∶0.5，6∶4∶1）梯度洗脫，根據(jù)TLC檢測(cè)結(jié)果合并成13個(gè)流分（1～13），其中總皂苷為組分9^[9]。

2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以5×103個(gè)/L的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)12 h，將上清替換成含藥培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，棄上清，加MTT（2.5 g·L-1）溫箱孵育2 h，棄上清，加入DMSO復(fù)溶顯色，用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度A。

2.4 Hoechst 33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞以3×104個(gè)/L接種于內(nèi)置無(wú)菌玻片的24孔板中，培養(yǎng)12 h至細(xì)胞貼壁，將上清換成含藥培養(yǎng)基。24 h后，棄去培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛固定30 min；將多聚甲醛吸走，加入PBS清洗，清洗3次；棄去PBS，加入Hoechst 33258染液，染色30 min；將染液吸走，加入PBS清洗，每次5 min，清洗3次。最后，在載玻片上滴加甘油，封片，用熒光顯微鏡（激發(fā)波長(zhǎng)352 nm，發(fā)射波長(zhǎng)461 nm）觀察（×200）細(xì)胞核形態(tài)。

2.5 表面鍵合TSAJ的固相微球制備 使用環(huán)氧基瓊脂糖凝膠微球，微球表面用1，4-雙（2，3-環(huán)氧丙烯基-）丁基作為連接臂偶聯(lián)環(huán)氧基團(tuán)。使用前，先將微球溶脹并清洗，取500 μL含水微球與500 μL TSAJ溶液混合，37 ℃孵育過(guò)夜即可。制備好的固相微球放置于4 ℃避光保存。

2.6 TSAJ靶點(diǎn)群的富集 將表面鍵合了TSAJ的固相微球與HepG2人肝癌細(xì)胞裂解液混合，置于4 ℃孵育過(guò)夜，然后用含0.01%NP40的洗脫緩沖液（50 mmol·L-1Tris pH 7.5，100 mmol·L-1NaCl，5 mmol·L-1EDTA，1 mmol·L-1DTT，0.01% NP40）清洗微球6次，離心并收集固相微球。加入含6 mol·L-1尿素和10 mmol·L-1DTT的PBS溶液，65 ℃加熱15 min，然后加入25 mmol·L-1碘乙酰胺繼續(xù)振搖孵育30 min。加入酶解緩沖液（2 mol·L-1尿素，1 mmol·L-1CaCl2，2 mg胰酶），37 ℃孵育過(guò)夜^[10]。

2.7 高分辨質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)鑒定和半定量分析 微球經(jīng)蛋白酶解后獲得混合肽段樣品，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后利用二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)（nano-LC-MS/MS）對(duì)各肽段進(jìn)行鑒定。nano-LC-MS/MS由EASY-nLC-Ⅱ液相色譜儀和LTQ-Orbitrap離子阱串聯(lián)質(zhì)譜（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）組成。吸取10 μL樣品溶液加樣至Captrap Peptide柱，洗脫除雜后進(jìn)入RP-C18AQ毛細(xì)管液相色譜柱（100 μm×15 cm，Michrom Bioresources，美國(guó)）進(jìn)行梯度分離。流動(dòng)相由0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈（B）組成，梯度洗脫條件為：0～105 min，2%～40%B；105～110 min，40%～95%B；110～120 min，95%B。洗脫流速為300 nL·min-1。采用正離子模式采集數(shù)據(jù)，電噴霧電壓為1.8 kV，質(zhì)譜掃描模式為全掃描，掃描范圍設(shè)置為m/z 350～2 000。利用蛋白質(zhì)組學(xué)分析軟件平臺(tái)Thermo Proteome Discoverer（1.4）所含的SEQUEST檢索軟件對(duì)獲得的PMF或CIDMS/MS肽段數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索匹配，鑒定蛋白質(zhì)成分并記錄響應(yīng)值。

2.8 潛在靶點(diǎn)篩選及蛋白功能解析 所有數(shù)據(jù)采用MataboAnalyst 3.0中的Biomarker Analysis模塊進(jìn)行t檢驗(yàn)（P<0.05）和倍數(shù)變化分析（Fold change≥2），篩選得到最終5個(gè)靶點(diǎn)蛋白。采用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中的UniProtKB搜索功能（http：//www.uniprot.org/，Update in 2017-06-22），通過(guò)輸入蛋白名稱并限定物種為人，將所有檢索得到的蛋白校正為其官方名稱（Official Symbol），經(jīng)上述數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和轉(zhuǎn)化操作，獲取靶點(diǎn)蛋白功能信息。endprint

3 結(jié)果與分析

3.1 TSAJ對(duì)人肝癌細(xì)胞系HepG2的生長(zhǎng)抑制作用 MTT法檢測(cè)了TSAJ對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，發(fā)現(xiàn)TSAJ在0.78～12.5 mg·L-1對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用具有濃度依賴性，見(jiàn)圖1，IC50為7.93 mg·L-1。

3.2 TSAJ顯著增加HepG2細(xì)胞凋亡率 為了進(jìn)一步驗(yàn)證TSAJ通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用，將不同濃度TSAJ給藥HepG2細(xì)胞，作用24 h后，通過(guò)Hoechst 33258法染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，TSAJ處理細(xì)胞后，細(xì)胞核隨給藥濃度增大越來(lái)越小，出現(xiàn)染色質(zhì)固縮的現(xiàn)象；核發(fā)出的藍(lán)色熒光逐漸增強(qiáng)，出現(xiàn)如黃色箭頭所示的核凋亡現(xiàn)象，見(jiàn)圖2。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，TSAJ能顯著增加HepG2細(xì)胞的凋亡率。

3.3 TSAJ作用靶點(diǎn)群的富集與鑒定 利用環(huán)氧基瓊脂糖凝膠固相微球作為載體，構(gòu)建了表面修飾了TSAJ的固相親和微球。TSAJ修飾后，固相微球顏色明顯加深。同時(shí)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，微球形狀沒(méi)有發(fā)生明顯改變，但微球表面質(zhì)感發(fā)生變化，反光性增強(qiáng)，進(jìn)一步確認(rèn)TSAJ成功鍵合在了固相微球表面，見(jiàn)圖3。

采用表面修飾了TSAJ的固相微球和HepG2人肝癌細(xì)胞裂解液進(jìn)行孵育，特異性地對(duì)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行富集。為了排除非特異性結(jié)合，實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置結(jié)合組和TSAJ競(jìng)爭(zhēng)組，向裂解液中加入TSAJ與表面鍵合TSAJ微球進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，通過(guò)比較2組微球上的結(jié)合蛋白來(lái)篩選TSAJ特異性結(jié)合靶點(diǎn)。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

采用LC-MS/MS高分辨質(zhì)譜對(duì)各組樣品進(jìn)行鑒定及半定量分析，并將數(shù)據(jù)用MataboAnalyst 3.0及UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)篩選靶點(diǎn)蛋白，得到的靶點(diǎn)蛋白名稱及功能見(jiàn)表1。

3.4 TSAJ作用靶點(diǎn)群的功能解析 通過(guò)UniProt搜索并發(fā)現(xiàn)，Exportin-2和Cytochrome c oxidase copper chaperone均與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡相關(guān)，其中Exportin-2為細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)通道受體蛋白，又稱細(xì)胞凋亡易感蛋白^[11]；Cytochrome c oxidase copper chaperone為細(xì)胞色素C氧化的銅配體，參與細(xì)胞呼吸作用，與細(xì)胞生長(zhǎng)關(guān)系密切^[12]。除此之外，Beta-actin-like protein 2與Myosin-9均為細(xì)胞的骨架蛋白，可能與腫瘤細(xì)胞分化、運(yùn)動(dòng)、分泌等活動(dòng)相關(guān)^[13]。而Protein transport protein Sec61 subunit beta則是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)合成及分泌轉(zhuǎn)運(yùn)的重要蛋白。因此猜測(cè)，TSAJ發(fā)揮抗腫瘤活性的機(jī)制可能與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞血管生成有關(guān)。

4 討論

藥物靶點(diǎn)是新藥研發(fā)的源頭，藥物新靶點(diǎn)的揭示與闡明對(duì)創(chuàng)新藥物研究具有巨大的推動(dòng)作用。中藥在我國(guó)有近千年的臨床使用歷史，療效穩(wěn)定、明確，但是中藥的成分復(fù)雜，從而導(dǎo)致了作用靶點(diǎn)的多樣性^[14]。因此，關(guān)于中藥活性成分作用靶點(diǎn)的研究一直是中藥研究領(lǐng)域中極具挑戰(zhàn)性的問(wèn)題。

合歡皮作為一味常用中藥，臨床上常用于治療失眠、焦慮、腫瘤等癥^[15]。近年來(lái)，合歡皮中主要成分TSAJ的抗腫瘤作用多有報(bào)道，然而由于皂苷類單體成分分離困難，具體抗腫瘤機(jī)制研究鮮有深入報(bào)道。本研究首先驗(yàn)證了TSAJ的抗腫瘤作用，然后以TSAJ為探針，富集并尋找了與其特異結(jié)合的靶點(diǎn)蛋白，從源頭上深入闡釋了TSAJ的抗腫瘤作用分子機(jī)制，解決了中藥成分復(fù)雜帶來(lái)的靶點(diǎn)多、作用機(jī)制不明的問(wèn)題。

通過(guò)對(duì)篩選得到的靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行功能解析，發(fā)現(xiàn)TSAJ發(fā)揮抗腫瘤活性的機(jī)制可能與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及血管生成有關(guān)。其中Exportin-2和Cytochrome c oxidase copper chaperone均與細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡相關(guān)，參與胞核胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞色素C氧化；此外還有細(xì)胞骨架蛋白Beta-actin-like protein 2與Myosin-9，參與腫瘤細(xì)胞分化、運(yùn)動(dòng)、分泌等活動(dòng)。然而，TSAJ與靶點(diǎn)蛋白作用機(jī)制及TSAJ誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究利用活性明確的中藥提取物作為探針，通過(guò)構(gòu)建了中藥提取物修飾的固相微球，富集并研究中藥提取物的直接作用靶點(diǎn)。這在中藥活性研究中尚不多見(jiàn)，有較高的新穎性，從源頭上解決了中藥因多成分多靶點(diǎn)所導(dǎo)致的分子機(jī)制不明的問(wèn)題，為中藥活性研究提供了新的思路。

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[責(zé)任編輯 張寧寧]endprint