川崎病患兒急性期單核細胞S100 A8/A9蛋白表達及其與冠狀動脈損害的關系

胡靜， 錢煒， 李紅， 李琪

川崎病患兒急性期單核細胞S100 A8/A9蛋白表達及其與冠狀動脈損害的關系

胡靜， 錢煒， 李紅， 李琪

目的探討單核細胞及炎性蛋白S100 A8/A9在川崎病的發展及冠狀動脈損傷的發生過程中可能起到的作用。方法選擇2010年1月至2012年12月無錫市兒童醫院心內科收治住院的川崎病患兒46例為研究對象，按冠狀動脈有無損害分為冠狀動脈損害組20例和無冠狀動脈損害組26例。同期選取本院行腹股溝疝氣擇期手術患兒40例為對照組。收集外周靜脈血，采用淋巴細胞分層液密度梯度離心法分離單個核細胞，提取總RNA，用RT-PCR法檢測S100 A8/A9 mRNA的表達，ELISA法檢測血漿S100A8/A9蛋白二聚體的水平。結果川崎病患兒急性期未予靜脈注射用免疫球蛋白治療時，冠狀動脈損害組和無冠狀動脈損害組血漿S100 A8/A9蛋白二聚體水平均顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；冠狀動脈損害組和無冠狀動脈損害組患兒在使用靜脈注射用免疫球蛋白前單核細胞中S100 A8/A9 mRNA表達均顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。冠狀動脈損害組血漿S100 A8/A9蛋白二聚體水平及S100 A8/A9 mRNA的表達高于無冠狀動脈損害組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論川崎病急性期單核細胞S100 A8/A9 mRNA表達及二聚體水平在使用靜脈注射用免疫球蛋白前均顯著高于對照組，提示S100 A8/A9可能參與了川崎病的發病機制。

川崎病； 單核細胞； S100 A8； S100 A9； 兒童

川崎病是一種兒科常見病，研究發現其發病率呈逐年增加的趨勢，且已經超過風濕熱，成為兒童后天性心臟病的最常見的原因之一[1]。川崎病的特點是急性全身性血管炎，其最重要的危害和并發癥是冠狀動脈擴張和冠狀動脈瘤的形成，并可引起成人期冠心病及猝死。目前其病因和發病機制仍未清楚。及時大劑量靜脈注射用免疫球蛋白(intravenous immunogloblin，IVIG)，治療可以明顯減少冠狀動脈損害的發生，但仍然有10%～15%的川崎病患兒發生冠狀動脈損害；10%的患兒對IVIG無效，且更易發生冠狀動脈損害[2-3]。

S100 A8/A9蛋白是S100鈣結合蛋白家族成員之一(即髓樣相關蛋白8、14)，主要由單核細胞、中性粒細胞分泌，存在許多慢性炎性疾病的滲出液中[4-5]，例如類風濕性關節炎、潰瘍性結腸炎、膽囊纖維化等，其蛋白的異二聚體可以特異性的和內皮細胞表面的特異受體結合，使內皮細胞表達細胞間黏附分子和細胞內黏附分子，引起局部血小板的聚集黏附形成微血栓。同時引起中性粒細胞和單核細胞的黏附[6]。S100 A8/A9可以消弱血管內皮細胞之間的連接，從而導致內皮細胞的酶依賴性和非酶依賴性死亡，進而破壞血管壁的完整[7]。鑒于川崎病的基本病理改變及S100 A8/A9對內皮細胞的作用，本研究通過對川崎病患兒和普通無發熱性疾病的患兒外周血S100 A8/A9蛋白水平及其mRNA的表達比較，從而探討兩者的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年1月至2012年12月無錫市兒童醫院心內科收治住院的川崎病患兒46例為研究對象，按冠狀動脈有無損害分為冠狀動脈損害組20例和無冠狀動脈損害組26例。冠狀動脈損害組中男12例，女8例；年齡5個月至3歲9個月，平均(2.2±1.8)歲。無冠狀動脈損害組中男18例，女8例；年齡6個月至5歲3個月，平均(1.8±1.7)歲。同期選取本院行腹股溝疝氣等擇期手術患兒40例為對照組，其中男22例，女18例；年齡9個月至6歲6個月，平均(2.4±1.8)歲。3組患兒在年齡、性別方面比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標準 參照《諸福棠實用兒科學》第7版中川崎病的診斷標準[8]。川崎病起病l、2和4周分別進行超聲心動圖檢查，冠狀動脈損害定義為：(1)冠狀動脈內膜回聲增強；(2)冠狀動脈內徑：年齡<3歲者>2.5 mm，3～9歲者>3 mm，>9～14歲者>3.5 mm；(3)冠狀動脈某一節段內徑超過相鄰節段內徑的1.5倍。

1.3 納入標準 (1)符合川崎病的診斷標準；(2)年齡0～7歲；(3)患兒家屬知情同意。

1.4 排除標準 患兒發熱及患有過敏性紫癜等免疫性疾病者。

1.5 研究方法

1.5.1 采集標本 患兒入院后取外周頸靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸抗凝處理，采用上海拜力淋巴細胞分離液，2 000 r/min離心20 min，離心后吸取云霧狀狹窄層帶即為單核細胞。

1.5.2 外周血單核細胞總RNA的提取 使用美國Sigma公司RAN抽提試劑盒按說明書操作提取RNA。

1.5.3 S100 A8/A9 mRNA的表達 PCR方法擴增完畢后，采用凝膠掃描系統測定電泳條帶的A值，以β-actin為內參照。計算目標條帶A值與β-actin條帶的A值之比值，即為擴增產物定量的相對值。并分離血清備用。

1.5.4 血清S100 A8/A9的蛋白水平 采用上海博谷生物公司27E10抗體，ELISA法檢測血清S100 A8/A9的水平，采用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度值，通過標準曲線計算樣品中濃度。引物用Primer 5.0軟件設計，由上海英俊生物技術有限公司設計合成，MRP-14上游引物：5′-TCC ACC AAT ACT CTG TGA AGC TG-3′，下游引物：CCT CCA TGA TGT GTT CTA TGA CC-3′，片段長度201 bp；MRP-8上游引物：5′-AAT TGC TAG AGA CGA GTG TCC TCA-3′，下游引物：5′-TGC CAC GCC CAT CTT TAT CA-3′，片段長度105 bp。

2 結果

3組患兒S100 A8/A9二聚體水平及mRNA表達的比較見表1。

表1 3組患兒S100 A8/A9二聚體水平及mRNA表達的比較

表1結果表明，川崎病患兒急性期未予IVIG治療時，冠狀動脈損害組和無冠狀動脈損害組血漿S100 A8/A9蛋白二聚體水平均顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；冠狀動脈損害組和無冠狀動脈損害組患兒在使用IVIG前單核細胞中S100 A8/A9 mRNA表達均顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。冠狀動脈損害組血漿S100 A8/A9蛋白二聚體水平及S100 A8/A9 mRNA的表達高于無冠狀動脈損害組，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

川崎病急性期單核細胞S100 A8/A9 mRNA在使用IVIG前均顯著高于對照組，提示單核細胞S100 A8/A9可能參與了川崎病的發病機制。免疫系統的高度活化及免疫損傷性血管炎是川崎病的顯著特點，研究表明在川崎病急性期，單核細胞、淋巴細胞明顯活化[9]，釋放大量炎型介質，如腫瘤壞死因子α、白細胞介素6、白細胞介素1等[10-11]，參與血管炎的發生，并且單個核細胞的趨化及穿壁運動也可以直接造成血管內皮的損害。有文獻報道在川崎病的急性期有持續的單核細胞增多癥，在發生冠狀動脈損害的患兒中更加明顯[12]。

Abe等[6]研究認為，川崎病患兒IVIG治療是通過改變S100 A8/A9等基因的表達來抑制川崎病的血管炎性反應。而且在Altwegg等[13]的研究中，認為在成人冠心病的急性發作期，血漿S100 A8/A9異二聚體水平也有明顯升高，而且可以比心肌酶譜、肌鈣蛋白等更敏感更早期的監測冠心病的急性發作。由此可以推斷S100 A8/A9在川崎病的發展及冠狀動脈損害的發生中起到一定作用。關于S100 A8/A9與川崎病的關系，目前只有Hirono等[14]報道過在中性粒細胞中表達變化，本研究以川崎病的炎性反應為基礎，從單核細胞的功能以及外周血清的S100 A8/A9蛋白二聚體的角度，探討單核細胞及炎性蛋白S100 A8/A9在川崎病的發展及冠狀動脈損傷的發生過程中可能起到的作用。

本研究結果顯示川崎病患兒急性期不僅有粒細胞數量增加，川崎病急性期單核細胞S100 A8/A9 mRNA在使用IVIG前均明顯高于對照組，提示S100 A8/A9可能參與了川崎病的發病機制。而冠狀動脈損害患兒單核細胞S100 A8/A9 mRNA表達水平較無冠狀動脈損害組升高明顯，并且冠狀動脈損害組S100 A8/A9異二聚體血清濃度明顯高于無冠狀動脈損害組，提示S100 A8/A9與川崎病冠狀動脈損害有一定相關性。目前，關于川崎病的病因及發病機制的研究有很多說法，尚無定論，大量研究報道認為川崎病患兒有大量炎癥因子如白細胞介素1、腫瘤壞死因子等釋放，但仍缺少實驗室診斷的金標準[15]，S100 A8/A9在川崎病發病及冠狀動脈損害過程中起重要作用，但致病因素如何引起血管炎癥反應及內皮損傷，其機制仍需進一步研究探討。

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ExpressionofS100A8/A9proteininchildrenwithacuteKawasakidiseaseanditsrelationshipwithcoronaryarterylesions

HUJing，QIANWei，LIHong，LIQi.

WuxiChildren'sHospital，Wuxi214000，China

ObjectiveTo investigate the role of S100 A8/A9 protein in the development of Kawasaki disease and the occurrence of coronary artery lesions.MethodsA total of 46 children with Kawasaki disease were included as the research subjects, who were treated in Wuxi Children's Hospital from Jan. 2010 to Dec. 2012,and they were divided into two groups based on whether there was coronary artery lesion or not: 20 in the with-lesion group(A) and 26 in the without-lesion group(B). Another 40 children receiving operation for inguinal hernia were chosen as the control group. Peripheral venous blood was collected; the monocytes were separated by stratified fluid density gradient centrifugation of lymphocytes; RNA was extracted; expression of S100 A8/A9 was detected by RT-PCR; the dimer level of plasma S100 A8/A9 was determined by ELISA.ResultsBefore the venous injection of immune globulin for children with acute Kawasaki disease, the dimer level of S100 A8/A9 protein in group A and group B was significantly higher than that in control group, the difference being statistically significant(P<0.05),while after the injection, the expression of S100 A8/A9 mRNA was significantly higher than that in control group, and there was statistical difference(P<0.05);the dimer level of S100 A8/A9 protein and S100 A8/A9 mRNA expression in group A were higher than those in group B, with statistical difference(P<0.05).ConclusionBefore venous injection of immune globulin, the S100 A8/A9 mRNA expression and dimer level is significantly higher than the control group, which suggests that S100 A8/A9 may be involved in the pathogenesis of Kawasaki disease.

Kawasaki disease； Monocytes； S100 A8； S100 A9; Child

R725

A

1674-3865(2017)05-0386-04

2017-01-12)

(本文編輯：吳迪)

214000 江蘇 無錫，無錫市兒童醫院心內科

胡靜(1981-)，女，醫學碩士，主治醫師。研究方向：小兒心血管系統疾病的診治

錢煒，E-mail：qianyizhou@163.com

10.3969/j.issn.1674-3865.2017.05.006