蟾酥活性成分協調索拉非尼通過下調Akt/NF-κB信號途徑抑制肝癌HepG2細胞生長

王志美，徐忠偉，王佳寶，代二慶，徐瑞成,4

(1. 錦州醫科大學中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬醫院研究生培養基地，天津 300162；2. 中國人民武裝警察部隊后勤學院中心實驗室，天津 300162；3. 中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬醫院軍人醫療保健中心，天津 300162；4. 天津市職業與環境危害生物標志物重點實驗室，天津 300309)

蟾酥活性成分協調索拉非尼通過下調Akt/NF-κB信號途徑抑制肝癌HepG2細胞生長

王志美1，徐忠偉2，王佳寶1，代二慶3，徐瑞成2,4

(1. 錦州醫科大學中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬醫院研究生培養基地，天津 300162；2. 中國人民武裝警察部隊后勤學院中心實驗室，天津 300162；3. 中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬醫院軍人醫療保健中心，天津 300162；4. 天津市職業與環境危害生物標志物重點實驗室，天津 300309)

目的探討蟾酥活性成分蟾蜍靈和華蟾毒配基協調索拉非尼抑制肝癌HepG2細胞生長的機制。方法MTT法檢測HepG2細胞經藥物作用12、24、48 h后的增殖活性；Hoechst 33342熒光染色檢測細胞形態學變化；流式細胞儀檢測藥物對HepG2細胞周期的影響；Western blot檢測Akt、p-Akt(Ser473)、IκB、NF-κB、p-NF-κB p65、Bcl-2、Bax、cyclin A、PCNA蛋白表達水平。結果蟾蜍靈、華蟾毒配基和索拉非尼作用組均能抑制HepG2細胞增殖，且藥物聯合作用組的增殖抑制率明顯高于單獨藥物作用組，呈時間依賴性，用金氏公式得出在24 h具有協同作用(P<0.01)；熒光染色結果顯示，HepG2細胞經藥物處理24 h后，細胞呈現出核染色質凝集的凋亡形態特征；細胞周期檢測結果顯示，索拉非尼作用組使細胞周期阻滯于G0/G1期(P<0.01)，蟾蜍靈、華蟾毒配基作用組使細胞周期阻滯于S期(P<0.01)，藥物聯合作用組使細胞周期阻滯于S期(P<0.01)；Western blot結果顯示，蟾蜍靈、華蟾毒配基和索拉非尼單獨藥物作用組和聯合作用組Akt、NF-κB總蛋白表達均無明顯變化，p-Akt(Ser473)、p-NF-κB p65、Bcl-2、cyclin A、PCNA蛋白表達水平逐漸降低，聯合作用組比單獨藥物作用組降低更為明顯(P<0.01)。IκB、Bax蛋白表達水平逐漸升高，聯合作用組比單獨藥物作用組升高更加明顯(P<0.01)。結論蟾酥活性成分蟾蜍靈和華蟾毒配基協調索拉非尼通過下調Akt/NF-κB信號通路，抑制肝癌HepG2細胞增殖。

索拉非尼；蟾酥；蟾蜍靈；華蟾毒配基；HepG2；Akt；NF-κB

原發性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是常見的惡性腫瘤之一，起病隱匿，進展迅速，預后極差[1]，大多數患者在確診時已進展到HCC晚期。索拉非尼是一種多靶點、多激酶抑制劑，是臨床治療晚期肝癌的一線用藥，有效延長HCC患者的生存時間。然而，HCC患者對索拉非尼可產生耐藥性，同時伴隨胃腸道疾病、手足皮膚病、心血管毒性等多種并發癥。這些并發癥可能一定程度上影響索拉非尼的治療效果。因此，篩選臨床中索拉非尼的效應增強劑或協同效應劑成為客觀需求[2]。蟾蜍靈(bufalin)以及華蟾毒配基(cinobufagin)是蟾酥發揮抗癌作用的主要活性成分，屬于外源性強心苷類物質，是天然的鈉鉀泵(Na+/K+-ATPase)抑制因子[3]。研究表明，蟾蜍靈和華蟾毒配基通過抑制Akt信號通路誘導乳腺癌、非小細胞肺癌細胞凋亡[4-5]，通過抑制NF-κB途徑誘導胰癌細胞周期阻滯和骨肉瘤細胞凋亡[6-7]。課題組前期研究發現，蟾蜍靈和華蟾毒配基作用HCC細胞可誘發細胞凋亡和細胞周期S期阻滯[8]。因此，本研究對蟾酥活性成分蟾蜍靈和華蟾毒配基聯合索拉非尼在抗HCC的藥理學作用機制中可能存在的協同和增效機制進行深入研究。

1 材料與方法

1.1材料人肝癌細胞株HepG2購自協和基礎醫學院細胞庫；蟾蜍靈、華蟾毒配基購自美國Sigma公司，無水乙醇溶解成母液，實驗終濃度為1 μmol·L-1，-20℃避光保存；H-DMEM 培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、碘化丙啶(PI)、Hoechst 33342、RNaseA、Triton X-100和二甲基亞砜(DMSO) 購自美國Sigma公司；一抗兔抗人Akt、p-Akt(Ser473)、IκB、NF-κB、p-NF-κB p65、Bcl-2、Bax、cyclin A、PCNA和GAPDH單克隆抗體購自美國Abcam公司；HRP標記的二抗和ECL化學發光試劑購自美國KPL公司。

1.2細胞培養及實驗分組HepG2細胞按常規方法培養。H-DMEM完全培養基中含有10%胎牛血清、1%青-鏈霉素、1%谷氨酰胺、1%丙酮酸鈉。實驗分為對照組、0.1 μmol·L-1索拉非尼組、1 μmol·L-1蟾蜍靈組、1 μmol·L-1華蟾毒配基組、1 μmol·L-1蟾蜍靈聯合0.1 μmol·L-1索拉非尼組、1 μmol·L-1華蟾毒配基聯合0.1 μmol·L-1索拉非尼組。

1.3MTT檢測細胞增殖活性取對數生長期HepG2細胞，以5 000個/孔的密度接種于96孔板，常規培養24 h后，按照預先設計的分組加入相應濃度的藥物，分別作用12、24、48 h后，加入20 μL MTT孵育3 h后，水平離心，1 500×g離心5 min，棄上清，加入150 μL DMSO，放入溫箱5 min，震蕩混勻，酶標儀測定A490nm值。計算細胞生長抑制率。抑制率/% =(A對照-A實驗)/(A對照- A空白)×100%。用金氏公式計算蟾酥活性成分聯合索拉非尼是否有協同作用：q=E(A+B)/(EA+EB-EA·EB)。式中EA、EB分別為單獨藥物作用組的抑制率，E(A+B)為藥物聯合作用的抑制率，q>1.15為協同作用，0.85～1.15為相加作用，<0.85為拮抗作用。實驗獨立重復3次。

1.4熒光顯微鏡觀察細胞形態實驗分組同前，藥物作用24 h后，離心，收集細胞，PBS洗4次，懸于200 μL PBS中，加入20 μL Hoechst 33342(終濃度為10 mg·L-1)，在37℃孵育箱中染色15 min，1 000×g離心10 min，棄上清，加入適量PBS，吹打混勻，每組細胞取3張玻片，200倍視野，在熒光顯微鏡下觀察細胞形態。實驗獨立重復3次。

1.5流式細胞術檢測細胞周期常規培養細胞，待細胞融合至80%時加藥，實驗分組同前。24 h后胰酶消化收集細胞，PBS洗凈胰酶后，細胞經預冷的75%乙醇固定過夜。上機前離心棄上清，PBS洗3次以充分洗凈固定液，加入100 μL染色劑(RNaseA 100 mg·L-1、50 mg·L-1PI、0.2% Triton X-100)，避光染色30 min后，加入400 μL預冷PBS，過300目尼龍網，流式細胞儀檢測細胞周期變化。實驗獨立重復3次。

1.6Westernblot法檢測蛋白表達常規培養細胞后加藥，胰酶消化收集各組細胞，PBS洗3次，在冰上加入RIPA裂解混合液，超聲細胞破碎儀破碎各組細胞，12 000×g離心10 min后留上清，BCA定量各組蛋白濃度。上樣50 μg，進行半干轉轉膜，轉移至 NC膜上。5%的脫脂奶粉常溫封閉 1 h，一抗(1 ∶1 000稀釋)Akt、p-Akt(Ser473)、IκB、NF-κB、p-NF-κB p65、Bcl-2、Bax、cyclin A、PCNA和GAPDH 4℃孵育過夜，TBST洗NC膜3次，每次15 min。二抗常溫孵育1 h，TBST洗膜4次，每次10 min。將NC膜置于暗盒中，滴加ECL液化學發光(A液 ∶B液=1 ∶1)，顯影定影，用Scion Image軟件進行灰度值分析。實驗獨立重復3次。

2 結果

2.1蟾酥活性成分與索拉非尼單獨以及聯合用藥對HepG2細胞增殖抑制有協同作用肝癌HepG2細胞經蟾蜍靈、華蟾毒配基和索拉非尼單藥處理及聯合處理后，在不同時間均能出現細胞增殖抑制作用。與單獨藥物作用組相比，藥物聯合作用組對細胞的增殖抑制率明顯增高(Tab 1、Fig 1)。1 μmol·L-1蟾蜍靈+0.1 μmol·L-1索拉非尼作用12、24、48 h時，q值分別為1.05、1.32、1.19。1 μmol·L-1華蟾毒配基+0.1 μmol·L-1索拉非尼作用12、24、48 h時，q值分別為 1.10、1.20、1.13，在藥物作用24 h時均表現為協同作用(P<0.01)。

Tab 1 Effects of bufalin, cinobufagin, sorafenib and their combinations on proliferation of HepG2 cells (±s, n=3)

**P<0.01vscontrol group

2.2蟾酥活性成分與索拉非尼單獨以及聯合用藥

Fig 1 Effects of bufalin, cinobufagin, sorafenib andtheir combinations on proliferation of HepG2 cells (±s, n=3)

A: Effects of bufalin, sorafenib and their combination on proliferation of HepG2 cells; B: Effects of cinobufagin, sorafenib and their combination on proliferation of HepG2 cells.**P<0.01vssorafenib group

誘導HepG2細胞凋亡形態變化經熒光染色后(Fig 2)，熒光顯微鏡下可見對照組HepG2細胞核較大，被Hoechst 33342染成均勻的藍色熒光。蟾蜍靈、華蟾毒配基和索拉非尼作用組24 h后，可見藍染、染色質凝集的凋亡細胞形態。藥物聯合作用組24 h后，藍染、染色質凝集的凋亡細胞形態大量出現。

Fig 2 Effects of bufalin, cinobufagin, sorafenib and their combinations on cell morphology of HepG2 cells (× 200)

A: Control group; B: Sorafenib group; C: Bufalin group; D: Cinobufagin group; E: Bufalin combined with sorafenib; F: Cinobufagin combined with sorafenib

2.3蟾酥活性成分與索拉非尼單獨以及聯合用藥對HepG2細胞周期的影響Fig 3流式結果顯示，正常對照組細胞G0/G1、S、G2/M期比例分別為69.61%、20.85%、9.54%。索拉非尼作用24 h后，G1期細胞比例為72.88%，與對照組相比，差異有顯著性(P<0.01)，呈現G0/G1期周期阻滯。蟾蜍靈和華蟾毒配基作用24 h后，處于S期的細胞比例分別為38.17%、34.53%，與對照組的20.85%相比，差異有顯著性(P<0.01)，呈現S期周期阻滯。聯合用藥24 h后，索拉非尼聯合蟾蜍靈以及索拉非尼聯合華蟾毒配基處于S期的細胞分別上升至39.08%和38.23%，與對照組的20.85%相比，差異有顯著性(P<0.01)，呈現S期周期阻滯。

Fig 3 Effects of bufalin, cinobufagin, sorafenib and their combinations on cell cycle of HepG2 cells(±s, n=3)

A: Control group; B: Sorafenib group; C: Bufalin group; D: Cinobufagin group; E: Bufalin combined with sorafenib; F: Cinobufagin combined with sorafenib; G: Changes of HepG2 cells S phases in proportion of bufalin, cinobufagin, sorafenib and their combination treatment.**P<0.01vscontrol group.

2.4蟾酥活性成分與索拉非尼單獨以及聯合用藥對HepG2細胞相關蛋白表達的影響

2.4.1蟾酥活性成分與索拉非尼單獨以及聯合用藥對HepG2細胞周期相關蛋白表達的影響 如Fig 4A所示，1 μmol·L-1蟾蜍靈、1 μmol·L-1華蟾毒配基與0.1 μmol·L-1索拉非尼單獨或聯合作用HepG2細胞24 h后，cyclin A、PCNA蛋白表達量下調，藥物聯合作用組明顯下調，與正常對照組相比，差異有顯著性(P<0.01)。Cyclin A、PCNA蛋白表達量的降低，提示蟾酥活性成分與索拉非尼聯合用藥可能引起HepG2細胞S期細胞周期阻滯。

2.4.2蟾酥活性成分與索拉非尼單獨以及聯合用藥對HepG2細胞凋亡相關蛋白表達的影響 如Fig 4B所示，1 μmol·L-1蟾蜍靈、1 μmol·L-1華蟾毒配基與0.1 μmol·L-1索拉非尼單獨或聯合作用HepG2細胞24 h后，Bcl-2蛋白表達量下調，藥物聯合作用組明顯下調，與正常對照組相比，差異有顯著性(P<0.01)。Bax蛋白表達量上調，藥物聯合作用組明顯上調，與正常對照組相比，差異有顯著性(P<0.01)。Bcl-2/Bax的比值下降，藥物聯合作用組下降明顯，與正常對照組相比，差異有顯著性(P<0.01)。Bcl-2/Bax的比值常作為細胞凋亡“分子開關”，其比值的下降使細胞對凋亡抑制作用減弱，細胞出現凋亡。

2.4.3蟾酥活性成分與索拉非尼單獨以及聯合用藥對HepG2細胞信號通路相關蛋白表達的影響 如Fig 4C所示，1 μmol·L-1蟾蜍靈、1 μmol·L-1華蟾毒配基與0.1 μmol·L-1索拉非尼單獨作用或聯合作用HepG2細胞24 h后，Akt、NF-κB總蛋白表達均無明顯變化；p-Akt(Ser473)、p-NF-κB p65蛋白表達量下調，藥物聯合作用組明顯下調，與正常對照組相比，差異有顯著性(P<0.01)。IκB蛋白表達量上調，藥物聯合作用組明顯上調，與正常對照組相比，差異有顯著性(P<0.01)。

3 討論

HCC的致死率居世界第2位，其發生發展與信號通路的異常密切相關。Akt信號通路是細胞內重要信號轉導通路之一。研究顯示，Akt信號通路在人類腫瘤細胞中普遍失調，因此，該通路為腫瘤靶向治療和預防轉移提供新的思路。Akt抑制劑GSK2110183、MK-2206在肺癌、胰腺癌以及血液惡性腫瘤中表現出很好的治療效果[9]。索拉非尼是一種多靶點的激酶抑制劑，經美國食品藥物管理局(FDA)批準用于晚期HCC的標準治療藥物。目前已有研究發現，索拉非尼可以通過下調Akt信號途徑，抑制人肝癌細胞株SMMC-7721的生長增殖[10]，但發現索拉非尼單獨作用于Akt信號通路，對信號途徑中的關鍵酶Akt、mTOR等磷酸化抑制作用卻有限[11]。同時，流行病學隊列研究顯示，索拉非尼僅僅能延長HCC患者生存3個月，并且具有多種不良反應。因此，篩選臨床中索拉非尼的效應增強劑或協同效應劑成為客觀需求[2]。已有研究表明，索拉非尼聯合培美曲塞通過抑制Akt途徑有效誘導非小細胞肺癌A549細胞凋亡[12]；索拉非尼聯合C2-神經酰胺通過抑制PI3K/Akt/mTOR和ERK信號通路，有效誘導肝癌細胞凋亡[13]。蟾酥及其相關制劑為我國傳統的抗腫瘤藥物，在我國廣泛用于肝癌、結腸癌、乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤的中晚期治療，療效明顯。蟾酥注射液聯合放化療有效治療中晚期肺癌、胃癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤[6]。相關研究報道，蟾蜍靈和華蟾毒配基通過抑制Akt信號通路，下調Bcl-2/Bax的比值，誘導結腸癌HCT116細胞和非小細胞肺癌細胞凋亡[6]。

A: The protein levels of cyclin A and PCNA in HepG2 cells treated with bufalin, cinobufagin, sorafenib and their combinations; B: The protein levels of Bcl-2 and Bax in HepG2 cells treated with bufalin, cinobufagin, sorafenib and their combinations; C: The protein levels of Akt/NF-κB signal in HepG2 cells treated with bufalin, cinobufagin, sorafenib and their combinations.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

本研究將蟾蜍靈、華蟾毒配基分別與索拉非尼聯合作用于肝癌HepG2細胞，結果顯示，蟾蜍靈、華蟾毒配基和索拉非尼對肝癌HepG2細胞均有抑制增殖的作用，且呈時間依賴性。藥物聯合作用時抑制增殖作用更加明顯，并在作用24 h后產生協同抑制效果。同時出現了染色質凝集等細胞凋亡形態，藥物聯合作用細胞凋亡形態更為明顯。流式結果顯示，索拉非尼將細胞阻滯在G1期，蟾蜍靈和華蟾毒配基單藥以及與索拉非尼聯合作用使細胞阻滯在S期。Cyclin A是正向細胞周期調控蛋白，在G1晚期出現合成，S期開始檢測到激酶活性，促進DNA的復制合成。PCNA是真核細胞DNA合成所必須的一種核蛋白，是DNA聚合酶的輔助蛋白，直接參與DNA的復制[8]， G1期后期開始出現，S期達到高峰，G2/M期明顯下降。本研究中發現，藥物聯合后cyclin A、PCNA的蛋白表達下降更為明顯，從而推斷藥物聯合以后可能引起S期細胞周期阻滯，抑制腫瘤細胞的增殖。

Akt信號通路是細胞內重要信號轉導通路之一，PI3K激活的Akt可以通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、caspase-9、NF-κB等，是重要的抗凋亡調節因子[14]。NF-κB是介導細胞內信號傳遞最重要的核轉錄因子，在多數細胞中，NF-κB以同源二聚體或異源三聚體的形式與其抑制蛋白IκB直接結合，形成三聚體復合物，以無活性形式存在于多種類型細胞內。當細胞受到刺激時，有信號誘導激活IκB激酶(IKK)，引起IκB的降解，使NF-κB快速入核，與DNA接觸，從而調控下游基因的表達。通過誘導抗凋亡因子Bcl-2蛋白家族，啟動凋亡抑制因子(X-chromosome linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)，促進癌基因c-Myc的激活，進而對凋亡信息產生抗性，與腫瘤的發生發展息息相關。相關研究報道，NF-κB的持續活化可作為包括乳腺腫瘤、卵巢腫瘤、直腸癌、胰腺癌、前列腺癌、黑色素瘤等實體瘤和白血病的標志[15]。提示我們，阻斷NF-κB的活化，抑制腫瘤細胞的增殖，誘導其凋亡為惡性腫瘤的治療提供了新的思路。Bcl-2家族蛋白在線粒體內源性凋亡通路中起著重要作用，Bcl-2具有拮抗細胞凋亡作用，Bax具有促進細胞凋亡的作用，Bcl-2與Bax的比值對藥物誘導的細胞凋亡起著決定性的作用[16]。本研究發現，藥物作用肝癌HepG2細胞后，單獨藥物作用組與藥物聯合作用組Akt、NF-κB總蛋白表達水平沒有明顯變化，但是，p-Akt(Ser473)、p-NF-κB p65蛋白表達明顯降低，且藥物聯合作用組降低程度更加明顯；Bcl-2蛋白表達水平逐漸降低，藥物聯合作用組降低程度更加明顯；IκB、Bax蛋白表達水平逐漸升高，藥物聯合作用組升高更為明顯。結果顯示，蟾蜍靈、華蟾毒配基聯合索拉非尼抑制Akt信號通路，直接或間接抑制IKK活性，減少IκB蛋白的降解，從而抑制NF-κB通路，減少Bcl-2蛋白表達水平，促進Bax的表達，使Bcl-2/Bax的比值下降，從而抑制細胞增殖和誘導凋亡。

綜上，蟾酥活性成分蟾蜍靈和華蟾毒配基協調索拉非尼通過下調Akt/NF-κB信號通路，抑制肝癌HepG2細胞增殖。

(致謝：本文實驗在天津武警后勤學院中心實驗室完成，衷心感謝課題組老師和同學的協助)。

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SynergywiththeactiveingredientsoftoadvenomandsorafenibsuppresseshepatocellularcarcinomaHepG2cellsproliferationthroughdown-regulatingAkt/NF-κBsignalingpathways

WANG Zhi-mei1, XU Zhong-wei2, WANG Jia-bao1, DAI Er-qing3, XU Rui-cheng2,4

(1.thePostgraduateCultureBaseofJinzhouMedicalUniversity-theAffiliatedHospitalofLogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce,Tianjin300162,China; 2.CentralLaboratoryLogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce,Tianjin300162,China; 3.theAffiliatedHospitalofLogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce,Tianjin300162,China; 4.KeyLabforBiomarkersofOccupationalandEnvironmentalHazard,Tianjin300309,China)

AimTo investigate the effect of the active ingredients of toad venom (bufalin and cinobufagin)combined with sorafenib on the growth of hepatocellular carcinoma HepG2 cells, and to explore the possible mechanism.MethodsThe rates of inhibition after treated with drugs 12, 24, 48 h were detected by MTT assay. The changes of cell morphology were detected by Hoechst 33342 fluorescent staining. The changes of cell cycle were detected by flow cytometry. The expressions of proteins such as Akt, p-Akt(Ser473), IκB, NF-κB, p-NF-κB p65, Bcl-2, Bax, cyclin A, PCNA were detected by Western blot.ResultsBufalin, cinobufagin and sorafenib could inhibit the proliferation of HepG2 cells, presenting a dose- and time-dependent manner. Meanwhile, it could significantly increase the inhibitory rate of cells compared with those of single treatment, and they performed a synergistic activity in sorafenib combined with cinobufagin or bufalin by Jin Formula after 24 h treatment (P<0.01). The results of fluorescence staining showed the observation of the morphological features of nuclear condensation. Sorafenib induced the cell cycle G0/G1phase arrest (P<0.01), and bufalin, cinobufagin and the combination treatment generated the cell cycle S phase arrest (P<0.01). The results of Western blot showed that the expressions of Akt, NF-κB were not obviously changed between control and all other treatment. The expression levels of p-Akt(Ser473), p-NF-κB p65, Bcl-2, PCNA and cyclin A in combination treatment significantly decreased, and the expression levels of IκB and Bax significantly increased compared to those in single treatment (P<0.01).ConclusionThe active ingredients of toad venom (bufalin and cinobufagin) combined with sorafenib performs a synergetic effect on the anti-cancer of HepG2 cells by down-regulating Akt/NF-κB signaling pathway.

sorafenib; toad venom; bufalin; cinobufagin; HepG2; Akt; NF-κB

A

1001-1978(2017)11-1510-07

R282.74；R329.24；R329.28；R735.7；R979.1

時間：2017-10-10 10:05 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20171010.1005.016.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.11.008

2017-08-19，

2017-09-21

國家自然科學基金資助項目(No 81673651，81273552，81273745)；武警后勤學院博士啟動金項目(No WHB201501)

王志美(1989-)，女，碩士生，研究方向：中西醫結合臨床，E-mail：1032924476@qq.com； 代二慶(1969-)，男，博士，教授，碩士生導師，研究方向：中西醫結合臨床，通訊作者，E-mail：13502136445@163.com； 徐瑞成(1968-)，男，碩士，教授，碩士生導師，研究方向：細胞信號轉導，通訊作者，Tel：022-84876451，E-mail：xu_rc@sohu.com