NADPH氧化酶在高脂誘導的人臍靜脈血管內皮細胞氧化應激損傷中的作用

許文虎，金春子，王曉龍，叢柏林，崔 蘭

(延邊大學附屬醫院1.心血管內科、2.中心實驗室，吉林 延吉 133000)

NADPH氧化酶在高脂誘導的人臍靜脈血管內皮細胞氧化應激損傷中的作用

許文虎1，金春子2，王曉龍1，叢柏林1，崔 蘭1

(延邊大學附屬醫院1.心血管內科、2.中心實驗室，吉林 延吉 133000)

目的探討NADPH氧化酶在高脂誘導的人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)氧化應激損傷中的作用。方法不同濃度(0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1)棕櫚酸(palmitic acid，PA)刺激HUVECs 0、12、24、48 h，CCK-8法檢測血管內皮細胞增殖能力；免疫印跡法檢測血管內皮細胞NADPH氧化酶亞基p22phox、p47phox、p67phox、gp91phox的表達水平；免疫熒光法檢測血管內皮細胞細胞內活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的表達水平。結果0.4 mmol·L-1PA刺激HUVECs 24、48 h組的細胞增殖率出現明顯降低。因此，實驗中我們采用0.4 mmol·L-1PA刺激24 h作為模型組；0.4 mmol·L-1PA刺激HUVECs 24、48 h時，p22phox、p47phox、p67phox、gp91phox的表達均明顯升高(P<0.05)，24 h組與48 h組差異不明顯(P>0.05); 0.4 mmol·L-1PA刺激血管內皮細胞24、48 h時,細胞內ROS表達水平均明顯增高(P<0.05)，24 h組與48 h組差異不明顯(P>0.05)；與模型組(0.4 mmol·L-1PA刺激24 h)相比，NADPH氧化酶抑制劑 diphenyliodonium(DPI，10 μmol·L-1)預處理可以使模型組血管內皮細胞ROS表達水平明顯下調(P<0.05)。結論NADPH氧化酶活性對高脂所致血管內皮細胞氧化應激損傷的防治有重要意義。

NADPH；高脂；棕櫚酸；人臍靜脈血管內皮細胞；氧化應激損傷；ROS

目前國內外文獻提出，多數心血管損傷與氧化應激有密切關聯[1-2]。氧自由基參與心血管系統多種生理病理過程，引發多種心血管疾病，尤其在動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)等血管內皮損傷的發生、發展過程中起重要作用[3-4]。AS主要是血管內皮細胞出現應激性損傷，成纖維細胞及平滑肌細胞等增生為關鍵性病變[5-8]。其主要特點是在大、中動脈內膜下脂質粥樣斑塊形成[9]。近年研究表明，高脂血癥可增加機體細胞脂質過氧化損傷，促進AS的形成和發展[10]。氧化應激學說是AS斑塊形成學說中的重要組成部分[11]。氧化應激屬于生物體在處于一些應激性損傷環境時，生物體內氧化與抗氧化之間的平衡失調，最終可出現生物體損傷[12]。基于此，本研究擬分析高脂對人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的NADPH氧化酶活性及細胞內活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平的影響，闡明NADPH氧化應激通路與高脂所致血管內皮細胞的氧化應激損傷之間的關聯，為脂毒性內皮損傷的防治提供新的靶點。

1 材料

1.1細胞系HUVECs購自上海基免實業有限公司。

1.2試劑p22phox、p47phox、p67phox、gp91phox抗體均購自美國Abcam公司；ROS檢測試劑盒、Cell Counting Kit 8(CCK-8)檢測試劑盒，購自碧云天生物技術研究所；DMEM培養基、胎牛血清、胰酶，均購自美國 Gibco公司；棕櫚酸(palmitic acid，PA)、NADPH氧化酶抑制劑diphenyliodonium(DPI)，均購自Sigma公司。

1.3儀器超凈工作臺(上海博訊實業有限公司)；二氧化碳培養箱(杭州利輝環境檢測設備有限公司)；熒光顯微鏡及倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；紫外分光光度計(上海凌析儀器有限公司)；多功能酶標儀(上海逍鵬生物科技有限公司)；高速冷凍離心機(德國Sigma公司)；電泳槽、電轉膜儀(Bio-Rad公司)；化學發光凝膠成像系統(美國ProteinSimple公司)等。

2 方法

2.1游離脂肪酸的配制用0.1 mol·L-1的NaOH溶液在70℃水浴中溶解一定量的PA，振蕩混勻10 min，過濾，配成100 mmol·L-1的PA儲存液。在55℃水浴中，用去離子水配50 g·L-1的BSA溶液，過濾。然后，將上述的PA溶液和BSA溶液按1 ∶19的體積比混合，配成PA/BSA復合液，在水浴中振蕩10 s，繼續水浴10 min，取出后冷卻至室溫，過濾。然后將上述復合液分別用高糖DMEM培養基稀釋。

2.2細胞培養HUVECs在細胞培養箱(飽和濕度、5% CO2、37℃)中培養至70%～80%融合度，經消化、傳代，進行實驗。采用的DMEM培養液包含10 mL·L-1雙抗、2 mmol·L-1的L-谷氨酰胺、10 mmol·L-1的HEPES、10 mmol·L-1的丙酮酸鈉、5 mmol·L-1葡萄糖。

2.3實驗分組① PA濃度梯度分析實驗: 對照組、PA組(0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1)。② PA時間梯度分析實驗: PA分別刺激0、12、24、48 h組。③ 抑制劑實驗: 對照組、0.4 mmol·L-1PA組、10 μmol·L-1DPI預處理2 h后給予0.4 mmol·L-1PA組。

2.4檢測指標

2.4.1CCK-8檢測細胞增殖率 HUVECs接種于96孔培養板中(每孔1×106個細胞)，培養24 h后給藥，進行孵育，每孔中加入10 μL CCK-8溶液反應2 h，酶標儀檢測570 nm處吸光度值，計算細胞增殖率。共重復3次，每組設6個復孔。

2.4.2Western blot法檢測NADPH信號通路蛋白表達水平 每組血管內皮細胞在細胞培養箱內培養過夜后，用PBS清洗2次，按組別給藥后，培養箱內孵育一定時間，4℃用裂解液裂解細胞30 min后，用細胞刮將培養板內細胞反復刮至離心管內，13 000 r·min-1離心15 min，蛋白定量后，取20 μL的蛋白樣品加入SDS-PAGE凝膠樣品槽內，經電泳、轉膜、封閉等過程后，加入NADPH 氧化酶亞基p22phox、p47phox、p67phox、gp91phox抗體，4℃孵育24 h，經洗膜、加入二抗室溫反應1 h后，用顯影液處理，用化學發光凝膠成像儀分析NADPH信號通路蛋白表達水平。

2.4.3ROS含量的檢測 6孔細胞培養板接種HUVECs，當細胞貼壁生長至70%～80%融合度，按組別給藥后，培養箱內孵育24 h，PBS反復沖洗后，細胞培養板內加入10 μmmol·L-1DCFH-DA，培養箱內孵育30 min，PBS反復沖洗后，采用熒光顯微鏡進行拍照，并用ImageJ 1.41軟件分析綠色熒光強度。

3 結果

3.1高脂對HUVECs細胞增殖功能的影響Fig 1A顯示，PA(0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1)刺激24 h 后，0.4、0.8 mmol·L-1PA組的血管內皮細胞增殖率均明顯降低(P<0.05)。Fig 1B顯示，0.4 mmol·L-1PA刺激0、12、24、48 h 后，刺激時間在24～48 h 時，血管內皮細胞增殖率均明顯降低(P<0.05)。

3.2高脂對HUVECs細胞NADPH氧化酶亞基活性表達的影響如Fig 2所示，0.4 mmol·L-1PA刺激0、12、24、48 h 后，刺激時間在24～48 h 時，NADPH 氧化酶亞基p22phox、p47phox、p67phox、gp91phox的蛋白水平出現高表達狀態(P<0.05)，而24 h PA刺激組與48 h PA刺激組之間的NADPH氧化酶亞基活性差異均無統計學意義(P>0.05)。

Fig 1 Influence of high fat on cell viability in HUVECs(±s, n=5)

A: Cell viability was significantly suppressed when palmitic acid(PA) concentration increased to 0.4 mmol·L-1; B: Cell viability was significantly suppressed when incubated time exceeded 24 h in 0.4 mmol·L-1PA.*P<0.05vs0 mmol·L-1group (A) or 0 h group (B).

Fig 2 Influence of high fat on expression of NADPH oxidase in HUVECs(±s, n=3)

A: Representative images of p22phox, p47phox, p67phoxand gp91phoxexpression by Western blot; B: Quantitative analysis of p22phox, p47phox, p67phoxand gp91phoxexpression.*P<0.05vs0 h group.

3.3高脂刺激時HUVECs細胞ROS水平的變化如Fig 3所示，0.4 mmol·L-1PA刺激0、12、24、48 h 后，刺激時間在24～48 h 時，細胞內ROS的水平出現高表達狀態(P<0.05)，而24 h PA刺激組與48 h PA刺激組之間的ROS水平差異無顯著性(P>0.05)。

3.4阻斷NADPH氧化酶通路對高脂下HUVECs細胞ROS水平的影響如Fig 4所示，0.4 mmol·L-1PA刺激24 h 后，細胞內ROS水平出現明顯升高(P<0.05)；而與單純PA(0.4 mmol·L-1)組相比，預處理NADPH氧化酶抑制劑DPI組ROS水平明顯降低(P<0.05)，與對照組之間差異無顯著性(P>0.05)。

4 討論

動脈粥樣硬化性疾病屬于人類慢性病中最常見且難以得到根治的疾病之一，往往稱其為心血管疾病中“頭號殺手”，死亡率較高。在全世界范圍內，因動脈粥樣硬化血栓形成導致死亡的人數占全部疾病死亡人數的52%，遠遠超過了列第2位死因的腫瘤(24%)，可以說動脈粥樣硬化性疾病已成為人類健康的第一殺手。目前，我國動脈粥樣硬化性疾病的發病率也在呈逐年上升的趨勢。動脈粥樣硬化的發病過程十分復雜，其確切病因尚未完全闡明，其危險因素有300多個，最早被公認的重要危險因素為高血脂、高血壓、吸煙、糖尿病等，其中，高血脂與動脈粥樣硬化等血管內皮損傷的相關性居首位，是其獨立危險因素[13]。因此，本研究建立了高脂所致血管內皮細胞損傷模型，旨在模擬脂毒性動脈粥樣硬化體系。

Fig 3 Effects of high fat on ROS of HUVECs

The intracellular level of ROS in HUVECs was estimated by DCFH-DA, a fluorescent probe. Fluorescence images of HUVECs stained with DCFH-DA after cells were incubated for 0 h (A), 12 h (B), 24 h (C) and 48 h (D) with 0.4 mmol·L-1PA. Scale bars: 50 μm. Quantitative analysis for the intensity of green fluorescence (E).*P<0.05vs0 h group

Fig 4 Influence of NADPH oxidase inhibitor DPI(10 μmol·L-1 ) on ROS of HUVECs exposed to high fat

The intracellular level of ROS in HUVECs was estimated by DCFH-DA, a fluorescent probe. Fluorescence images of HUVECs stained with DCFH-DA after cells were incubated for 24 h with control (A), 0.4 mmol·L-1PA (B) and 0.4 mmol·L-1PA+10 μmol·L-1DPI (C). Scale bars: 50 μm. Quantitative analysis for the intensity of green fluorescence (D).*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsPA

另一方面，近年來動脈粥樣硬化基礎理論和動脈粥樣硬化性疾病的防治研究也取得突破性進展，出現了許多新理念。例如氧化應激學說，氧化應激屬于生物體在處于應激環境時，生物體內ROS積累過多，以至于無法得到有效清除，體內氧化/抗氧化平衡被打亂，最終出現生物體損傷。其中ROS是主要環節，ROS在體內的生成需要有幾種酶的參與，其中NADPH氧化酶最為重要[14]。NADPH氧化酶定位于吞噬細胞質膜上，是一種黃素細胞色素，為多系統成分，主要包括黃素蛋白、細胞色素b558和輔酶Q等，它們組成了一個類似于電子傳遞鏈樣的酶系統，當遇到應激源激活時，NADPH氧化酶能夠將NADPH的電子傳遞給分子氧，生成超氧陰離子。NADPH 氧化酶可被高脂激活，NADPH 源性ROS的生成過多，氧化應激體系的平衡受到破壞，最終損傷組織或細胞。NADPH 氧化酶是由p22phox、p47phox、p67phox、gp91phox、p40phox、Rac1 6種亞單位組成的復合體[15]。本研究提示，高脂刺激血管內皮細胞24 h后，NADPH氧化酶磷酸化亞基 p22phox、p47phox、p67phox、gp91phox蛋白的表達明顯升高，說明NADPH通路的激活可能與高脂誘導的血管內皮細胞損傷有密切關聯。

在氧化應激過程中，其主要作用的物質是ROS。ROS在小劑量時能作為第二信使存在于生物體內，使生物體的正常生命活動得到有效的維持。一旦生物體氧化應激過度時，ROS的產生過量，使生物體無法有效清除過多的ROS，出現ROS在體內的過度蓄積。ROS過度產生不同程度損傷了生物體內脂質、蛋白質、核酸等物質正常的生命活動及功能，直接或間接地對生物體產生程度不一的毒性作用，嚴重時導致生物體細胞出現壞死或凋亡。本研究提示，高脂刺激24 h時，血管內皮細胞內ROS水平就出現明顯升高，而與單純高脂組相比，高脂+NADPH氧化酶抑制劑DPI組ROS水平出現明顯降低，此現象說明血管內皮細胞可在高脂的刺激下出現明顯的氧化應激損傷，且此損傷與NADPH氧化酶通路的激活密切相關。

綜上所述，高脂刺激可抑制血管內皮細胞的增殖能力，激活NADPH氧化酶通路，使細胞處于氧化應激狀態，而此狀態成功被NADPH氧化酶抑制劑所阻斷。此結果證實，調控NADPH依賴性氧化應激信號通路對血管內皮細胞損傷的防治有指導意義。

(致謝: 本文實驗主要在延邊大學基礎學院藥學分析實驗室、藥理學實驗室，延邊大學附屬醫院中心實驗室完成，由湖北科技學院醫藥研究院省重點實驗室協助完成，感謝參與人員廉麗花副教授、李晶副教授，碩士生馬偉平、金艷紅、權麗娜等對本實驗的幫助與指導。)

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RoleofNADPHoxidaseinhighfat-inducedoxidativestressinjuryinhumanumbilicalveinendothelialcells

XU Wen-hu1, JIN Chun-zi2, WANG Xiao-long1, CONG Bo-lin1, CUI Lan1

(1.DeptofCardiovascularDiseases, 2.CentralLaboratory,AffiliatedHospitalofYanbianUniversity,YanjiJilin133000,China)

AimTo explore the role of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate(NADPH) oxidase in high fat-induced oxidative stress injury in human umbilical vein endothelial cells(HUVECs).MethodsHUVECs were exposed to different concentrations of palmitic acid(0.1, 0.2, 0.4, 0.8 mmol·L-1) for 24 h and different time points of 0.4 mmol·L-1palmitic acid(0, 12, 24, 48 h). Cell viability was measured by Cell Counting Kit 8, and the protein expression of NADPH oxidase subunits such as p22phox, p47phox, p67phoxand gp91phoxwere determined by Western blot. The expression of reactive oxygen species(ROS) in HUVECs was detected by immunofluorescence.ResultsCell proliferation rate of HUVECs stimulated by 0.4 mmol·L-1palmitic acid for 24 h and 48 h was significantly reduced. In the next experiment, model group was accordingly set as HUVECs stimulated by 0.4 mmol·L-1palmitic acid for 24 h. The expression of NADPH oxidase subunits such as p22phox, p47phox, p67phoxand gp91phoxsignificantly increased at 24 h and 48 h after 0.4 mmol·L-1palmitic acid stimulation (P<0.05), and the difference between the 24 h group and the 48 h group was not significant (P>0.05). The expression of ROS in HUVECs significantly increased at 24 h and 48 h after 0.4 mmol·L-1palmitic acid stimulation (P<0.05), and the difference between 24 h group and 48 h group was not significant (P<0.05). Compared with the model group (0.4 mmol·L-1palmitic acid stimulation for 24 h), the NADPH oxidase inhibitor diphenyliodonium (DPI, 10 μmol·L-1) pretreatment could significantly decrease the expression of ROS in vascular endothelial cells (P<0.05).ConclusionActivated NADPH oxidase might play an important role in treatment of high fat-induced oxidative stress injury in vascular endothelial cells.

NADPH；high fat；palmitic acid；human umbilical vein endothelial cells；oxidative stress injury；ROS

A

1001-1978(2017)11-1574-05

R322.12；R329.24；R345.4；R349.1；R977.3

時間：2017-10-10 10:05 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20171010.1005.038.html

2017-07-13,

2017-08-11

湖北省教育廳科學研究計劃項目(No B201696)；湖北科技學院糖尿病專項基金項目(No 2016-18XZ09)

許文虎(1979-)，男，碩士，主治醫師，研究方向：心血管病變，E-mail：xuwenhu3077@163.com； 崔 蘭(1969-)，女，博士，主任醫師，研究方向：心血管病變，通訊作者，E-mail：cuilan1205@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.11.019