紅花多糖對人非小細胞肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響

董婭 趙鈺玲 范亞莉 楊栓盈 魚軍 王娟紅 王琦俠 李建英

紅花多糖對人非小細胞肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響

董婭1，2趙鈺玲1，2范亞莉1，2楊栓盈3魚軍4王娟紅5王琦俠6李建英1

目的探討不同濃度的紅花多糖(safflower polysaccharide,SPS)對人非小細胞肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響。方法根據臺盼藍染色法繪制細胞生長曲線及計算細胞活力；用不同濃度(0.04,0.08,0.16,0.32,0.64,1.28,2.56mg/mL)的紅花多糖處理A549細胞24、48、72h后在倒置顯微鏡下觀察細胞形態學改變；四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測不同濃度(0.04,0.08,0.16,0.32,0.64,1.28,2.56mg/mL)的紅花多糖對人非小細胞肺癌細胞體外生長的抑制作用，AnnexinV-FITC/PI熒光雙標流式細胞術檢測細胞凋亡率。結果臺盼藍染色后發現在第2-6天細胞呈對數生長，在第3-5天細胞活力最好；不同濃度SPS處理24,48,72h后，各時間點均以0.64mg/mL的SPS抑制率最高；不同濃度SPS處理48h后，倒置顯微鏡下A549細胞表現為皺縮、變圓等細胞凋亡性；各濃度組A549細胞的凋亡率增加呈劑量依賴性，而1.28mg/mL組除外。結論紅花多糖能明顯抑制人非小細胞肺癌A549細胞的增殖，誘導A549細胞的凋亡，在SPS濃度為0.64mg/mL最為顯著。

A549細胞；紅花多糖；增殖；凋亡

紅花是活血化瘀藥的代表藥，藥理作用廣泛，《中藥藥理學》明確指出紅花具有抗腫瘤作用[1]，現代藥理學研究表明[2-3]，紅花還具有抗氧化、抗凝血、降血壓以及免疫調節等多種藥理活性。紅花多糖(safflower polysaccharide,SPS)是從紅花中提取的有效活性成分，近年來關于多糖抗腫瘤的研究逐漸增多,多糖通過抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡及抑制細胞周期等。有研究發現，SPS具有抗腫瘤及增強機體免疫功能[4-5]、保護大鼠腦缺血再灌注損傷[6]；明顯增強H22荷瘤小鼠的免疫功能，清除自由基、減輕活性氧造成的損傷[7]。前期研究證實，紅花多糖可通過調節細胞調亡及細胞周期，實現對胃癌、肝癌、乳腺癌、結腸癌、宮頸癌[8-12]等惡性腫瘤細胞的體外抑制作用，但其對非小細胞肺癌細胞的作用及其機制尚未明確,本文旨在研究SPS對人非小細胞肺癌細胞增殖、凋亡的影響，以期為肺癌的治療尋找新的治療方法及理論基礎。

資料與方法

一、實驗材料

1 細胞株：人非小細胞肺癌A549細胞株由第四軍醫大學生化實驗室提供。

2 主要儀器：Multiskan Mk3酶標儀(Thermo公司)，流式細胞儀(BD FACSCalibur)。

3 主要試劑：臺盼藍(TRYPAN BLUE),MP Biomedical.LLC公司,批號MR29186；四甲基偶氮唑藍(MTT) Sigma公司，批號:M2128；RPMI-1640培養基,Hyclone公司，批號：ABA211779；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司 批號150130)；0.25%胰蛋白酶消化液,Solabio公司，批號：20160421；二甲基亞砜(DMSO) Sigma公司批號：D5879；Annexin V-FITV 細胞凋亡檢測試劑盒，Miltenyi Biotec GmbH,貨號：5160412036。

4 藥品：紅花多糖(上海瑞康生物 批號20160504 純度90%)。

二、實驗方法

1 細胞培養及傳代：將人非小細胞肺癌A549細胞接種于培養瓶中，放入37℃、5%CO2培養箱中培養，每隔12-24小時在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態，取對數生長期的細胞進行實驗。

2 不同濃度的紅花多糖對非小細胞肺癌A549細胞形態的影響：取對數生長期的非小細胞肺癌A549細胞，分別加入200 uL 0.04 mg/mL、0.08 mg/mL、0.16 mg/mL、0.32 mg/mL、0.64 mg/mL、1.28mg/mL、2.56 mg/mL 七個濃度的紅花多糖，在24h、48h、72h在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態學變化，并拍照。

3 人非小細胞肺癌A549細胞生長曲線的測定：取對數生長期的人非小細胞肺癌A549細胞，制成濃度為104個/mL 的單細胞懸液，培養24 h 后，任取3孔用臺盼藍染色法進行活細胞細胞計數，總共持續計數9d，且重復獨立實驗3次，按照平均值繪制生長曲線。

4 人非小細胞肺癌A549細胞生長活力的測定：取對數生長期的非小細胞肺癌A549細胞，制成濃度為104個/mL 的單細胞懸液，培養24 h 后，任取3孔計數，并用臺盼藍染色法單獨進行活細胞細胞計數，總共持續計數9d，且重復獨立實驗3次，按照下面公式計算細胞活力。

細胞活力=(細胞總數—死細胞數)/細胞總數×100%

5 MTT法檢測：取對數生長期的非小細胞肺癌A549細胞，以5×104個/孔的濃度接種于無菌的96孔培養板，按照MTT法常規進行，在酶聯免疫檢測儀490 nm處檢測各孔吸光度值(OD)。按照下面公式計算細胞生長抑制率(inhibition rate,IR%)：生長抑制率(IR%)=[1-實驗組平均OD值/空白最照組OD值]×100%

6 SPS對A549細胞凋亡的影響：將對數生長期的人肺癌細胞A549用0.25%胰蛋白酶進行消化后，以2×105個/孔的濃度接種到無菌的6孔細胞培養板，按照Annexin V-FITV 細胞凋亡檢測試劑盒步驟處理標本后放入流式細胞儀中進行檢測，將激發波長Ex設置為488nm，發射波長Em設置為530nm 并計算細胞凋亡率。

三、 統計學分析

結 果

一、 SPS對A549細胞形態的影響 對照組A549細胞貼壁良好，呈梭形貼壁生長，不同濃度的SPS處理48h后，細胞的形態發生了明顯變化，表現為細胞整體萎縮、變圓、細胞折光減弱等典型細胞凋亡性狀, 在SPS濃度 0.64mg/mL時最顯著(見圖1)

二、 A549細胞生長曲線的測定(見圖2)

三、 A549細胞細胞活力的測定(見圖3)

四、 SPS對A549細胞增殖的影響

SPS作用后人非小細胞肺癌A549細胞生長明顯受抑制，呈現一定程度的時間、濃度依耐性，表現為隨著濃度的增高，作用時間的延長，抑制率增高，各時間點均以0.64mg/mL的SPS抑制率最高，劑量升高至1.28mg/mL的時抑制率反而下降(見表1)。

五、各濃度SPS作用48h對A549細胞凋亡的影響

雙變量流式細胞儀的散點圖(見圖4)左下象限為正常活細胞( AnnexinV- /PI-)；右下象限為早期凋亡細胞( AnnexinV+ /PI-)；右上象限為晚期凋亡或壞死細胞( AnnexinV+ /PI+ )；而左上象限為細胞膜破損細胞( AnnexinV-/PI+)[13]。

圖1 不同濃度的SPS作用48h對A549細胞形態的影響(倒置顯微鏡×100)

注：A:對照組SPS濃度0mg/mL；B: SPS濃度0.04mg/mL； C: SPS濃度0.08mg/mL；D:SPS濃度 0.16mg/mL；E:SPS濃度0.32mg/mL； F:SPS濃度0.64mg/mL； G：SPS濃度1.28mg/mL； H：SPS濃度2.56mg/mL

圖2 0-192h A549細胞的生長曲線圖

圖3 第1-8天A549細胞活力圖

表1 不同濃度的SPS對A549細胞增殖的影響

*P<0.05

SPS作用A549細胞48h后各組細胞的凋亡率增高，以0.64mg/mL凋亡率最高。(見圖4)。

討 論

肺癌是嚴重威脅人類生命健康的常見惡性腫瘤之一，近年來，其病死率和發病率呈逐年遞增趨勢,非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是一種上皮組織來源的惡性腫瘤，占肺癌的80%，5年生存率不到15%[14], 傳統的治療方法如手術、放療及化療等不良反應大，療效欠佳，這與NSCLC的發病機制不明、缺乏有效的治療手段密切相關，因此,研究其發生、發展的分子機制，并從中尋找有效的治療手段已成為NSCLC研究領域迫切需要解決的問題。目前，越來越多的中草藥及其提取物應用于NSCLC的治療，多種中草藥對病灶穩定性、生存期和生活質量有顯著改善，并有抗復發轉移潛在優勢。有研究發現，SPS可抑制肺癌細胞的生長及轉移，增強T淋巴細胞的增殖能力，在腫瘤免疫中發揮著重要作用[15]，它的抗腫瘤作用機制可能與增強CTL、NK細胞的毒活性有關[4]。但SPS作用于NSCLC細胞的靶途徑、靶位點、靶分子及信號轉導機制等仍不明確，因此需要進行進一步的深入研究。

圖4 SPS作用A549細胞48h的凋亡率

注： A:對照組SPS濃度0mg/mL B: SPS濃度0.08mg/mL C :SPS濃度0.16mg/mL; D: SPS濃度 0.32mg/mL； E:SPS濃度0.64mg/mL；F:SPS濃度1.28mg/mL

本實驗主要觀察不同濃度SPS對人NSCLC A549細胞增殖與凋亡的影響，初步探討SPS對人NSCLC細胞的抑制機制，為防治提供可能的治療策略。

本研究首先從形態學上觀察SPS可能誘導人NSCLC A549細胞凋亡，在倒置顯微鏡下觀察不同濃度的SPS作用后A549細胞貼壁細胞減少，細胞間隙增大，且部分細胞變圓，體積縮小，部分細胞懸浮在培養基中，在0.64mg/mL SPS作用48h后最為顯著；再通過臺盼藍染色，細胞計數法繪制細胞的生長曲線及計算細胞活力，發現在第2-6天細胞呈對數生長，在第3-5天細胞活力最好；在MTT抑制試驗中，不同濃度SPS作用后人NSCLC A549細胞生長明顯受抑制，呈現一定程度的時間、濃度依耐性，表現為隨著濃度的增高，作用時間的延長，抑制率增高，各時間點均以0.64mg/mL的SPS抑制率最高；最后通過流式細胞儀檢測細胞凋亡，發現SPS作用A549細胞48h后各組細胞的凋亡率增高，以0.64mg/mL凋亡率最高。

綜上所述，SPS能明顯抑制人NSCLC A549細胞的增殖，并可誘導A549細胞的凋亡，在SPS濃度為0.64mg/mL最為顯著，但SPS對人NSCLC細胞的更深層次作用機制還需要進一步研究，為臨床應用提供可靠的論據。

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Effectofsafflowerpolysaccharideonproliferationandapoptosisinhumannon-smallcelllungcancercelllineA549

DONGYa,ZHAOYu-ling,FANYa-li,YANGShuan-ying,YUJun,WANGJuan-hong,WANGQi-xia,LIJian-ying

DepartmentofRespiratoryDisease,Xi’anCentralHospitalAffiliatedtoMedicalcollegeofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an,Shaanxi710003,China

ObjectiveTo investigate the potential anti-apoptotic effect of safflower polysaccharide on A549 cells of human non-small cell lung cancer.MethodsTrypan blue staining was used to count the alive cells in order to draw a cellular growth curve and calculate cell viability. A549 cells were treated with different concentrations (0.04, 0.08, 0.16, 0.32, 0.64, 1.28 and 2.56 mg/mL) of SPS for 24, 48 and 72 hours. Inverted Micro-scope was used to observe the morphological changes of A549 cells. Different doses of safflower polysaccharide (0.04, 0.08, 0.16, 0.32, 0.64, 1.28 and 2.56 mg/mL) were added to A549 cells. The MTT assay was performed to reveal the inhibitory effect on cell proliferation. Flow cytometry using annexin V-FITC/PI staining was employed to measure cell apoptosis.ResultsThe Trypan blue staining showed the 2nd to 6th days was logarithmic growth phase and cell viability was the best from the 3rd to 5th days. After being treated by SPS for 24, 48 and 72 hours, the highest inhibition rate was 0.64mg/mL. After being treated by SPS for 48h, evident morphological changes including membrane shrinking, rounding shaping and budding to form apoptotic characters were observed. SPS treatment inhibited the proliferation in a dose-dependent manner and the rate of cell apoptosis was increased also in a dose-dependent manner except 1.28mg/mL.ConclusionSPS could inhibit the proliferation of A549 and enhance apoptosis of A549 especially in 0.64mg/mL.

A549 cells; safflower polysaccharide; proliferation; apoptosis

2017-03-20]

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.11.030

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