特定因子誘導豬胎兒成纖維細胞重編程為多能性細胞的研究

李 雪，王玉閣，文麗波，王 濱，姚宏波，趙 堃

（1．齊齊哈爾醫學院生理教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161000；2．齊齊哈爾醫學院組織胚胎教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

?實驗研究?

特定因子誘導豬胎兒成纖維細胞重編程為多能性細胞的研究

李 雪2，王玉閣1，文麗波1，王 濱1，姚宏波1，趙 堃2

（1．齊齊哈爾醫學院生理教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161000；2．齊齊哈爾醫學院組織胚胎教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

目的應用特定因子誘導豬胎兒成纖維細胞重編程為多能性細胞。方法 應用經典的Yamanaka方法，誘導豬胎兒成纖維細胞重編程，創建形態以及特征與豬上胚層細胞來源相似的豬多能性細胞（pig induced pluripotent cells，piPCs）。結果 應用特定因子誘導豬胎兒成纖維細胞重編程為piPCs。該細胞AKP染色陽性；體外長期傳代都保持正常的染色體核型。結論 成功的應用特定因子誘導豬胎兒成纖維細胞重編程為豬多能性細胞。

豬成纖維細胞；重編程；誘導多能干細胞

誘導性多能干細胞（iPS細胞）技術經過近15年的發展，在生物學、醫學等領域取得了重大突破，對疾病的基礎研究和轉化均具有重要意義。模式動物豬因其具有特殊生理結構，尤其是小型豬的器官體重和大小都與人體非常相似、由于取材便利、基因序列和人類相似程度較高的優勢，一直成為國內外研究的熱點[1]。誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）的建立，為體細胞重編程創建了新方法。目前，已有文獻報道建立了豬iPS細胞，但在細胞多潛能特性分析中仍存在差異[2]。本實驗應用特定因子誘導胎豬成纖維細胞重編程，并在重編程的過程中對培養體系進行優化，創建與豬上胚層細胞來源相似的多能性細胞，且在體外經過長期傳遞后仍維持未分化狀態。該成果的取得為進一步探討豬胚胎干細胞多能作用、以及對畜牧業生產工作提供重要的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗中采用的豬胎兒成纖維細胞來源于妊娠35～40天的豬胚胎。培養基、Oct4，Sox2，c-Myc、胎牛血清（FBS）以及Klf4四種逆轉錄病毒試劑均購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 誘導及培養豬多能性細胞

選擇第2代胎豬成纖維細胞，按一定密度接種，培養24 h后，按等比例的感染劑量將hOct4、hSox2、hc-Myc、hKlf4四種逆轉錄病毒液混合加入，加4 μg/mL聚凝胺（polybrene）以促進病毒粘附。24 h后，進行重復感染。24 h后，記為D0。從D0到D7，在培養液中添加2 mM VPA，隔天換液。D8，重新接種在飼養層細胞上，用iPS培養液培養。D14，培養皿中若發現突出于飼養層細胞表面，高核質比，大核仁，邊緣整齊的與豬上胚層細胞形態類似的克隆。經過形態學方式選擇出典型的克隆，傳代擴增。

1.2.2 堿性磷酸酶AKP（alkaline phosphatase）染色

按照堿性磷酸酶顯色試劑盒（購自Beyotime公司）說明書操作后，鏡下分析染色結果。

1.2.3 核型分析

選取對數生長期中的豬多能性細胞（P30），在培養液中注入秋水仙素（10 μg/mL），培養箱孵育1.5 h。向細胞中注入KCL溶液（0.075 mol/L）37℃作低滲處理15 min。混合溶液4℃保持20 min。離心后將懸浮細胞利用膠頭滴管以0.5米的高度滴到-20℃預冷的載玻片上。Giemsa染液進行染色10 min，在流動水下沖洗后油鏡開始觀察染色體標本，計數后拍照。

1.2.4 Real-time PCR分析

在病毒感染后D12，分別提取mRNA，進行Real-time PCR擴增，檢測應用不同培養溫度對重編程的影響。組別如下：a，37℃、b，39℃。取1 μg mRNA經RT-PCR試劑盒逆轉錄得到相應的cDNA，以上述cDNA為模版。引物序列，擴增片段長度，退火溫度見表1。

表1 各種引物序列及退火溫度

1.2.5 統計數據及分析

實驗數據經Student t-檢驗進行統計學計算分析，P＜0.05為差異性有顯著性意義，所有數據用均數±標準差表示。

2 結 果

2.1 培養溫度對重編程的影響

豬正常體溫為39℃，為了確定培養溫度對細胞重編程的影響，我們將胎豬成纖維細胞及病毒因子誘導后的細胞分別置于37℃和39℃條件下的培養箱分別培養，觀察是否39℃的培養條件會提高重編程效率。在重編程早期，即四種病毒因子感染成纖維細胞后的D12，對2種溫度條件下的細胞進行real-time PCR檢測，以測定早期重編程階段豬內源性多潛能因子Oct4，Sox2，Nanog，Klf4的表達水平，結果如圖1所示：兩種溫度下分別培養的細胞在早期重編程因子的啟動表達方面未見顯著差異，說明培養溫度對豬成纖維重編程的影響較小。

圖1 real-time PCR檢測分別應用37℃和39℃培養條件，豬多潛能基因的表達水平

2.2 胎豬多能性細胞的建立

誘導流程如圖2A所示。在D0至D7持續添加2 mM VPA。在D8將細胞接種于飼養層上，改換iPS培養液，換液時觀察細胞形態變化。從D12開始，在鏡下觀察到少量的細胞呈上皮樣生長，其形態明顯區別于成纖維細胞；D14，出現1～2個集落樣形態生長的克隆，隨著誘導時間的延長，集落數量逐漸增多；在D20，我們觀察到了比較典型的類似小鼠ES形態的克隆。細胞形態變化如圖2B所示。

圖2B 豬多能性細胞建立過程中細胞形態學改變

2.3 豬多能性細胞多潛能性鑒定

我們所建立的piPCs顯現出高水平的堿性磷酸酶活性能力，呈棕色，如圖3a。該細胞經過體外長期傳代后（P30）仍具有正常染色體核型（2n=38）如圖3b。

圖3 豬多能性細胞的鑒定

3 討 論

iPS技術開創了細胞重編程的全新方法，本文研究中發現，我們利用小鼠和人iPS細胞建立的方法[3,4]，對豬胎兒成纖維細胞進行誘導重編程，創立了piPCs細胞。但至今尚未建立豬ES細胞系，與細胞生物學特性有關的報道相對較少，所以在豬多能性細胞鑒定中存在很大的爭議[5,6]。本次實驗中，我們將病毒感染后的細胞分別用39℃和37℃進行培養，進行Real-time PCR檢測內源性多潛能基因的表達，結果顯示重編程開啟后內源性轉錄因子的表達水平并沒有顯著差異，說明培養溫度對早期豬體細胞重編程沒有促進作用，但是溫度是否對豬體細胞重編程晚期有促進作用還需要進一步的驗證。綜上，雖成功建立豬多能性細胞的前期結果令人振奮，但豬多能性干細胞的研究領域仍然存在許多問題有待解決。例如，從根本上表述體細胞重編程、豬多能性干細胞自我更新以及定向分化的分子調控機制等，在今后實驗中仍然值得深入研究。

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[2]薛冰華,劉忠華.豬多能性干細胞研究進展與前瞻[J].生物技術通報,2015,31(4):82-91.

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ISSN.2095-8242.2017.042.8141.02

本文編輯：王雨辰