一種國(guó)產(chǎn)丙肝抗體檢測(cè)試劑在血液篩查中的應(yīng)用評(píng)價(jià)

范加誠(chéng)*，華玉娟，蘇 濤，范風(fēng)濤

（泰安市紅十字會(huì)中心血站，山東 泰安 271000）

一種國(guó)產(chǎn)丙肝抗體檢測(cè)試劑在血液篩查中的應(yīng)用評(píng)價(jià)

范加誠(chéng)*，華玉娟，蘇 濤，范風(fēng)濤

（泰安市紅十字會(huì)中心血站，山東 泰安 271000）

目的通過(guò)與核酸檢測(cè)（NAT）以及一種基于間接法免疫檢測(cè)原理的酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑相比較，評(píng)估另一種基于雙抗原夾心法免疫檢測(cè)原理的ELISA試劑在獻(xiàn)血者丙肝檢測(cè)方面的表現(xiàn)。方法 用NAT和兩種免疫檢測(cè)原理的ELISA試劑分別對(duì)39976份無(wú)償獻(xiàn)血者血樣進(jìn)行平行檢測(cè)，并采用丙肝病毒抗體重組免疫印跡（HCV RIBA）試劑進(jìn)行補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)，分析比較結(jié)果。結(jié)果 在檢測(cè)HCV Ab上，夾心法原理ELISA試劑特異性優(yōu)于間接法原理ELISA試劑，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），前者與NAT比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 夾心法原理ELISA試劑與NAT結(jié)合應(yīng)用于獻(xiàn)血者丙肝病毒篩查，可以有效減少漏檢和降低由假反應(yīng)性造成的血液報(bào)廢。

雙抗原夾心法；HCV；ELISA；NAT；血液篩查

丙型肝炎也是一種危害嚴(yán)重的傳染性疾病，由丙型肝炎病毒（HCV）感染發(fā)病，HCV主要經(jīng)血液傳播感染，在我國(guó)十分流行[1]，感染率約3.2%[2]。目前，我國(guó)血站采用間接法免疫檢測(cè)原理的酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑檢測(cè)丙肝病毒抗體（HCV Ab），該方法用于血液篩查十分有效，但是依舊存在漏檢與假陽(yáng)性等問(wèn)題[3]。而采用雙抗原夾心法免疫檢測(cè)原理的ELISA試劑能從方法學(xué)的基礎(chǔ)原理上有效地解決了間接法免疫檢測(cè)原理中所存在的某些缺陷，并且在近年雙抗原夾心法原理的ELISA試劑在HBsAg、HIV Ag/Ab和梅毒TP等的相關(guān)檢測(cè)中都獲得了比較成功的實(shí)踐效果，具有更好的特異性和靈敏度。本實(shí)驗(yàn)室自2016年初即開始采用雙抗原夾心法和間接法兩種免疫檢測(cè)原理的ELISA試劑同時(shí)用于獻(xiàn)血者血樣HCV Ab的篩查，并采用核酸（NAT）進(jìn)行HCV RNA檢測(cè)，得到大批量標(biāo)本檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行性分析，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月～2016年10月本血站采集的無(wú)償獻(xiàn)血者標(biāo)本39976份，5 mL EDTA-K2抗凝劑3管，其中1管為惰性分離膠試管用于核酸檢測(cè)，標(biāo)本保存于4℃冰箱，4 h內(nèi)分離血漿，于48 h內(nèi)完成檢測(cè)，反應(yīng)性標(biāo)本吸取血漿后-40℃冰柜凍存?zhèn)溆糜赗IBA補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器與試劑

試劑A：雙抗原夾心法酶聯(lián)免疫丙肝病毒檢測(cè)試劑（北京萬(wàn)泰公司，批號(hào)：CS20151007，CS20160403）；試劑B：間接法酶聯(lián)免疫丙肝病毒檢測(cè)試劑（上海科華公司，批號(hào)：201511281，201604141）；核酸檢測(cè)試劑：羅氏三聯(lián)血篩試劑MPX2.0（羅氏診斷公司，批號(hào)：193607）；RIBA試劑：丙肝病毒重組免疫印跡HCV RIBA（北京萬(wàn)泰公司，批號(hào)：RC20160501）；Tecan EVO 150/8智能加樣器（瑞士帝肯公司），Hamilton FAME 24/20酶免處理系統(tǒng)（瑞士Hamilton 公司），XK95-Ⅰ型多用振蕩器（江蘇新康公司）。

1.3 方法

每份血樣均采用試劑A、試劑B平行檢測(cè)HCV Ab，并且同步采用核酸檢測(cè)（NAT）試劑檢測(cè)HCV RNA，以上檢測(cè)出的所有反應(yīng)性樣本均采用HCV RIBA進(jìn)行補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)。所有檢測(cè)結(jié)果均嚴(yán)格按照所用試劑說(shuō)明書要求進(jìn)行判讀。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

通過(guò)SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用x2檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 試劑A、試劑B以及核酸試劑的檢測(cè)

同時(shí)對(duì)39976份無(wú)償獻(xiàn)血者標(biāo)本采用試劑A、試劑B以及NAT進(jìn)行平行檢測(cè)，檢出反應(yīng)性標(biāo)本48例，其中試劑A反應(yīng)性標(biāo)本21例，試劑B反應(yīng)性標(biāo)本43例，NAT反應(yīng)性標(biāo)本9例。試劑A與試劑B檢測(cè)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，表1），試劑A與NAT檢測(cè)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01，表1）。

表1 試劑A、試劑B以及NAT的檢測(cè)

2.2 反應(yīng)性標(biāo)本的RIBA補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)

48例反應(yīng)性標(biāo)本均采用RIBA試劑進(jìn)行補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)，其中確認(rèn)陽(yáng)性11例，不確定5例，陰性32例。兩種ELISA法及NAT檢測(cè)結(jié)果與RIBA結(jié)果對(duì)應(yīng)情況見表2。兩種ELISA試劑均有反應(yīng)性的標(biāo)本中RIBA確認(rèn)陽(yáng)性結(jié)果11例（11/16，68.75%），RIBA不確定結(jié)果5例（5/16，31.32%）。11例RIBA陽(yáng)性標(biāo)本中有9例RNA反應(yīng)性（9/11，81.82%），2例RNA無(wú)反應(yīng)性（2/11，18.18%）。32例RIBA陰性標(biāo)本中單試劑A反應(yīng)性標(biāo)本5例（5/32，15.63%），單試劑B反應(yīng)性標(biāo)本27例（27/32，84.37%）。

表2 48例標(biāo)本補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果（n）

3 討 論

目前，血站實(shí)驗(yàn)室對(duì)于HCV Ab檢測(cè)一般都會(huì)采用間接法原理的酶聯(lián)免疫試劑，即用有酶標(biāo)記的抗人IgG作為第二抗體，對(duì)血漿/清中的抗HCV IgG進(jìn)行相關(guān)的檢測(cè)[4]，但是由于血漿/清中一些非特異性IgG吸附和一些類風(fēng)濕因子的干擾等.也很容易造成一些假陽(yáng)性反應(yīng)出現(xiàn)[5]，從而造成一些不必要的血源浪費(fèi)。血站傳染病篩查項(xiàng)目HBsAg、HIV Ag/Ab和TP均已采用雙抗原夾心法原理的酶聯(lián)免疫試劑，并且在實(shí)際使用中表現(xiàn)出良好的特異性及靈敏度。雙抗原夾心法原理主要是利用酶標(biāo)抗原代替間接方法當(dāng)中的相關(guān)酶標(biāo)記二抗，從方法學(xué)上有效地解決了在間接法中存在的一些缺陷，所以從理論上具有更好的特異性和靈敏度。同時(shí)，在一些相關(guān)研究中也表明酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)所涉及的夾心法與間接法HCV Ab檢測(cè)仍會(huì)存在一定程度漏檢[6]。

本研究結(jié)果顯示雙抗原夾心法原理的酶聯(lián)免疫試劑與間接法原理的試劑的檢測(cè)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=4.80，P＜0.05），RIBA檢測(cè)結(jié)果陰性標(biāo)本中夾心法酶免試劑檢測(cè)假陽(yáng)性率為15.63%而間接法酶免試劑假陽(yáng)性率為84.37%，提示夾心法酶免試劑的特異性明顯優(yōu)于間接法酶免試劑，并且在實(shí)際應(yīng)用中前者采用50微升標(biāo)本加樣量而后者采用10微升標(biāo)本加樣量，標(biāo)本加樣量的增加可以更加有效地避免實(shí)驗(yàn)操作中由于加樣量不足或漏加而造成的漏檢現(xiàn)象。近幾年為了避免“窗口期”感染的漏檢而引入核酸檢測(cè)（NAT）應(yīng)用于血液安全篩查中，但是從以上檢測(cè)數(shù)據(jù)可以得出NAT檢測(cè)不能單純替代ELISA法，二者只能互為補(bǔ)充，表1顯示NAT與ELISA法檢測(cè)結(jié)果具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=7.57，P＜0.01），表2顯示2例ELISA法雙試劑均為反應(yīng)性且RIBA確認(rèn)陽(yáng)性標(biāo)本而NAT為無(wú)反映性，分析原因可能有：1、HCV RNA含量低于檢出限或RNA間歇復(fù)制造成NAT假陰性結(jié)果[7-8]；2、感染后病毒已清除但抗體持續(xù)存在[9]。

綜上所述，采用夾心法原理的酶聯(lián)免疫試劑在丙肝抗體檢測(cè)方面明顯優(yōu)于間接法原理的試劑，具有更好的特異性及敏感性，前者試劑替代后者試劑應(yīng)用于采供血機(jī)構(gòu)大批量血液篩查中，能極大程度地降低由于檢測(cè)假反應(yīng)性而造成的血源浪費(fèi)。同時(shí)，據(jù)報(bào)道NAT極大地縮短了丙肝檢測(cè)的“窗口期”，可將HCV 70天窗口期縮短到10～14天[10]。所以該夾心法原理的酶聯(lián)免疫試劑替代傳統(tǒng)的間接法試劑，與NAT結(jié)合應(yīng)用于獻(xiàn)血者丙肝篩查，從方法學(xué)上做到互為有益的補(bǔ)充，能夠更加有效地保證臨床輸血安全。

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Evaluation of the application of a domestic HCV ELISA assay in blood screening

FAN Jia-cheng*,HUA Yu-juan,SU Tao,FAN Feng-tao
(The Taian Blood Bank,Shandong Taian 271000,China)

Hepatitis C virus;Sandwich method;ELISA;Blood Screening

R446.6

A

ISSN.2095-8242.2017.042.8252.02

泰安市科技發(fā)展基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2015NS1125）

范加誠(chéng)，男，醫(yī)學(xué)碩士，副主任技師，主要從事血液安全篩查和實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理方面的工作，E-mail：fjctttt2008@126.com

本文編輯：王雨辰

【Abastrac】ObjectiveTo evaluate the differences of domestic reagent that is Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in hepatitis C blood screening by comparing using Indirect ELISA and nucleic acids (NAT) detection.Methods A total of 39976 donor samples were tested for HCV detection through parallel detection by Sandwich ELISA,Indirect ELISA and NAT.The HCV reactive samples were con firmed by recombinant immunoblot assay (RIBA).Analysis and comparison were conducted on all results. Results The specificity of Sandwich ELISA reagent was higher than Indirect ELISA reagent (P＜0.05).And there was difference between Sandwich ELISA reagent and NAT (P＜0.01).Conclusion Using both domestic Sandwich ELISA reagent and NAT together for detection of hepatitis C,that can effectively reduce the number of undetected blood samples and avoid false reactive.