血清饑餓對人白血病細胞株THP-1細胞增殖、細胞死亡和細胞自噬的影響

高 雪,鄭曉琦,劉為忠,劉德勝,張 靜,潘效紅

(濱州醫學院藥學院細胞工程研究室,煙臺 264003;*通訊作者,E-mail:panxiaohong@bzmc.edu.cn)

血清饑餓對人白血病細胞株THP-1細胞增殖、細胞死亡和細胞自噬的影響

高 雪,鄭曉琦,劉為忠,劉德勝,張 靜,潘效紅*

(濱州醫學院藥學院細胞工程研究室,煙臺 264003;*通訊作者,E-mail:panxiaohong@bzmc.edu.cn)

目的 本實驗通過血清饑餓處理人急性單核細胞白血病細胞株THP-1,探究血清饑餓對細胞增殖、細胞死亡和細胞自噬的影響及其機制。 方法 實驗分為4組:0% FBS組、1% FBS組、5% FBS組和10% FBS組(對照組),血清饑餓時長為24 h和48 h。通過MTT法檢測細胞增殖,臺盼藍拒染法檢測細胞死亡,流式細胞術測定吖啶橙(AO)的熒光強度,免疫印跡法檢測自噬相關蛋白Atg5、 Atg7和LC3Ⅱ表達。 結果 與對照組相比,不同程度血清饑餓處理24 h和48 h均可以顯著抑制THP-1細胞增殖(P<0.05),細胞增殖呈現一定的血清濃度依賴性和饑餓時間依賴性。血清饑餓處理24 h和48 h可以顯著增加細胞死亡率(P<0.05),并增加細胞內酸性自噬體囊泡的形成。免疫印跡顯示,血清饑餓顯著性增強自噬相關蛋白Atg5,Atg7和LC3Ⅱ的表達(P<0.05)。 結論 血清饑餓可降低THP-1細胞增殖,增加細胞死亡率和自噬。

THP-1細胞; 血清饑餓; 細胞增殖; 細胞死亡; 細胞自噬

細胞自噬是一種高度保守的細胞降解過程,可將部分胞質和細胞器隔離在自噬溶酶體中進行分解,將分解得到的大分子進行回收利用。自噬在腫瘤發生和治療中具有重要意義,可以影響腫瘤細胞增殖、侵襲和死亡等方面[1]。自噬對腫瘤細胞的影響是把“雙刃劍”:一方面,當腫瘤細胞快速增殖時,細胞會處于營養物質和氧氣匱乏的狀態。自噬通過及時清除有害物質、破損細胞器和回收可利用物質,為細胞的生存提供合成原料,幫助腫瘤細胞緩解代謝壓力,度過營養不足等多種脅迫條件的不利影響。另一方面,當自噬時間過長、細胞數量過多或某些抗腫瘤藥物作用時,自噬則會促進細胞死亡[2-4]。急性單核細胞白血病是急性髓細胞白血病的M5亞型,是可引起白血病細胞浸潤的造血系統惡性腫瘤,嚴重危害人類健康。自噬對急性髓細胞白血病同樣存在兩方面作用:可以維持細胞生存或促進細胞死亡,但白血病發病過程中自噬的作用機制仍不明確。

血清饑餓是指將細胞培養于低血清或無血清的基礎培養基中,是常用的細胞饑餓方法。生物機體在饑餓條件下通常可激活自噬過程,通過細胞自我消化、降解及維持細胞內環境的穩定。近年來研究表明,血清饑餓是比全營養素缺失饑餓更好的一種自噬誘導方式,血清饑餓誘導的自噬可以維護細胞增殖和存活[5,6]。本研究以人急性單核細胞白血病THP-1細胞為研究對象,通過檢測血清饑餓對細胞增殖、細胞死亡和細胞自噬的影響,為研究白血病細胞自噬與死亡的關系、細胞自噬對細胞生存調控的分子機制等提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 細胞株及主要試劑

人急性單核細胞株THP-1購自武漢博士德生物工程有限公司;MTT粉末、二甲基亞砜(DMSO)、吖啶橙粉末購自美國Sigma-Aldrich公司;RPMI 1640基礎液體培養基購自美國Hyclone公司;胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;臺盼藍染液購自上海碧云天生物技術有限公司;兔抗人Atg5抗體, 兔抗人anti-Atg7抗體, 兔抗人anti-LC3抗體,兔抗人anti-GAPDH抗體和羊抗兔二抗全部購自美國CST公司。

1.2 細胞培養

THP-1細胞生長于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的1640培養基中,在37 ℃、5% CO2、飽和濕度下培養。根據細胞生長情況換液和傳代,實驗所用細胞均為對數生長期細胞。

1.3 MTT法檢測細胞增殖

實驗設置0% FBS組、1% FBS組、5% FBS組及10% FBS組(對照組),每組設置5個平行孔。THP-1細胞按密度2×104個/ml接種于96孔板,每孔180 μl細胞液。0% FBS組加入20 μl RPMI 1640基礎培養基,其他組分別加入相應濃度血清。培養24 h和48 h,每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml),37 ℃下避光孵育4 h去除溶液,每孔加入100 μl DMSO溶解結晶,酶標儀490 nm處測定吸光度值(A)。

1.4 臺盼藍拒染法檢測細胞死亡

細胞按每孔5×104個細胞接種于24孔板中,0% FBS組加入RPMI 1640基礎培養基,1%FBS組、5% FBS組和10% FBS組分別加入一定濃度血清。培養24 h和48 h,細胞懸液和0.4%臺酚藍以9 ∶1混合作用10 min,在光鏡下細胞計數板計數活細胞和死細胞數量。

1.5 吖啶橙(AO)染色檢測自噬溶酶體形成

細胞按每孔5×104個細胞接種于24孔板中,0% FBS組加入RPMI 1 640基礎培養基,1%FBS組、5% FBS組和10% FBS組分別加入相應濃度血清培養24 h。收集細胞,用PBS洗滌細胞1次,加入AO染液(使用濃度為1 μg/ml),37 ℃避光染色15 min。用PBS洗滌細胞,并重懸細胞制成單細胞懸液體,流式細胞儀檢測各組細胞中熒光強度。

1.6 Western印跡法檢測蛋白表達

細胞培養24 h后用RIPA裂解液裂解細胞,提取總蛋白。應用BCA法進行蛋白質定量。制備12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),每孔上樣量為80 μg,常規電泳后轉移至PVDF膜 (Millipore,Bedford,MA),5%脫脂奶粉常溫封閉1 h,加入一抗4 ℃孵育過夜。PBST緩沖液洗滌2次,PBS緩沖液洗滌1次,10 min/次。辣根過氧化物酶標記二抗室溫孵育1 h,PBST緩沖液洗滌2次,PBS緩沖液洗滌1次,5 min/次。進行增強化學發光法(ECL)檢測,將結果掃描后用QuantityOne軟件進行灰度值分析。GAPDH為內參照,目的條帶灰度值與內參照灰度值作比較。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 血清饑餓對THP-1細胞增殖的影響

細胞增殖實驗設置0% FBS組、1% FBS組、5% FBS組及10% FBS組，其中10% FBS培養條件為細胞正常培養條件，為對照組。MTT法檢測表明，細胞培養24 h與對照組相比，0% FBS組的細胞增殖率為47.70%±10.60%，1% FBS組的細胞增殖率為76.55%±1.39%，5% FBS組的細胞增殖率為88.64%±7.41%。細胞培養48 h與對照組相比，0% FBS組的細胞增殖率為16.19%±8.53%，1% FBS組的細胞增殖率為48.71%±2.98%，5% FBS組的細胞增殖率為87.23%±4.51%。血清饑餓24 h和48 h結果顯示，血清對細胞增殖有顯著影響(P<0.05)，呈現血清濃度依賴性。血清濃度越高，細胞增殖能力越強。對0% FBS組和1% FBS組來說，血清饑餓對細胞增殖也有時間依賴性，血清饑餓時間越長，細胞增殖能力越弱。對10% FBS組來說，血清饑餓對細胞增殖沒有顯著時間依賴性(見圖1)。

組間比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，ns表示P>0.05圖1 血清饑餓對THP-1細胞增殖的影響Figure 1 The effects of serum deprivation on cell proliferation in THP-1 cells

2.2 血清饑餓對THP-1細胞存活的影響

臺盼藍拒染法結果顯示，細胞培養24 h，0% FBS組的細胞死亡率為(81.89±2.50)%，1% FBS組的細胞死亡率為(55.56±9.62)%，5% FBS組的細胞死亡率為(13.94±5.9)%，10% FBS組的細胞死亡率為(13.89±9.77)%。細胞培養48 h，0% FBS組的細胞死亡率為(95.83±7.22)%，1% FBS組的細胞死亡率為(62.17±4.65)%，5% FBS組的細胞死亡率為(10.13±2.34)%，10% FBS組的細胞死亡率為(3.11±2.72)%(見圖2)。 因此，血清含量影響THP-1細胞存活能力，血清含量不足，可顯著增加細胞死亡率(P<0.05)。

組間比較，*P<0.05,**P<0.01，ns表示P>0.05圖2 血清饑餓對THP-1細胞死亡率的影響Figure 2 The effects of serum deprivation on cell death in THP-1 cells

2.3 血清饑餓對THP-1細胞自噬的影響

通過流式細胞法檢測吖啶橙熒光強度顯示，細胞培養24 h，0% FBS組的平均熒光強度為(93.43±1.40)%，1% FBS組的平均熒光強度為(87.17±1.96)%，5% FBS組的平均熒光強度為(67.80±2.71)%，10% FBS組的平均熒光強度為(53.33±2.89)%(見圖3)。 結果顯示血清饑餓可誘導THP-1細胞自噬發生，并呈現血清濃度依賴性。

組間比較，*P<0.05,**P<0.01圖3 血清饑餓對THP-1細胞內熒光強度的影響Figure 3 The effects of serum deprivation on intensity of AO in THP-1 cells

2.4 血清饑餓對自噬相關蛋白表達的影響

Western blot實驗結果顯示與對照組相比，0% FBS組LC3Ⅱ表達顯著增強(P<0.05)，隨著血清濃度增加，LC3Ⅱ表達降低，但10% FBS組表達與1% FBS組相近，無統計學差異。 檢測Atg5蛋白結果顯示，0% FBS組表達增強(P<0.05)，1% FBS組和5% FBS組表達無顯著性差異，10% FBS組表達最低(見圖4)。檢測Atg7蛋白結果顯示，0% FBS組表達增強(P<0.05)，隨著血清濃度增加，Atg7表達顯著降低。

3 討論

細胞自噬是真核生物中普遍存在的、對細胞生長及死亡的重要調控機制,與腫瘤等多種人類疾病有關。自噬對腫瘤發生發展的作用非常復雜,常表現為兩面性:一方面,自噬是細胞針對多種脅迫條件(如營養限制和氧化脅迫)的一種細胞應答過程;另一方面,自噬又是促進細胞死亡的主要原因[5,7]。白血病是以白血病細胞的異常增殖,在臟器的廣泛浸潤等臨床表現為主的造血系統性腫瘤。根據白血病細胞的成熟程度,可將白血病分為急性和慢性兩大類。人急性單核細胞白血病是急性髓細胞白血病的M5亞型,有骨髓衰竭和細胞浸潤等癥狀[8]。現已知的藥物、維生素、光損傷等均可誘導白血病細胞發生自噬性死亡,進而起到殺死癌細胞的作用[9-11]。本實驗通過血清饑餓方式誘導細胞發生自噬,從而探究血清饑餓與細胞生存和細胞自噬之間的關聯。

組間比較，*P<0.05,**P<0. 01,***P<0.001，ns表示P>0.005圖4 血清饑餓對自噬相關蛋白Atg5,Atg7和LC3Ⅱ表達的影響Figure 4 The effect of serum deprivation on the expression of Atg5,Atg7 and LC3Ⅱ in THP-1 cells

誘導細胞自噬的饑餓處理中包括很多方式,包括全營養素剝奪、血清饑餓及氨基酸饑餓等。其中血清饑餓是在細胞培養過程中使用了不含血清成分的基礎培養基,使細胞缺乏血清中含有的營養物質,導致細胞饑餓的方法,此方法避免了細胞能量供應不足而產生的細胞損傷。本研究顯示,血清饑餓可抑制THP-1細胞增殖,且呈一定血清濃度依賴性和作用時間依賴性。本研究通過MTT法檢測體外增殖發現,血清濃度對細胞增殖影響明顯。血清饑餓24 h, 5% FBS組的增殖與對照組相比無顯著性差異,饑餓24 h時中濃度血清可維持THP-1細胞的增殖,但饑餓48 h時中濃度血清不足以維持細胞正常增殖,表明中濃度血清培養條件可能是通過自噬進行營養物質的回收利用來保持細胞的增殖狀態。臺盼藍拒染法結果顯示,血清饑餓處理24 h時,0% FBS組和1% FBS組中,細胞死亡率較高,而5% FBS組和10% FBS組細胞死亡率無顯著性差異。從理論上講,5% FBS組含有少量營養和生長因子,短時間能維持細胞生存,細胞死亡率與對照組相比無顯著性差異,表明短時間的血清濃度不足,細胞發揮其內在機制可以維持細胞生存。因此,本研究猜測,一定濃度和一定時間的血清饑餓可能誘導細胞自噬等機制維持細胞生存。

吖啶橙是一種顯熒光的堿性染料,可與細胞內酸性小泡融合,細胞內含有自噬溶酶體可被吖啶橙染色。 本實驗將細胞用吖啶橙染色后進行流式細胞法檢測細胞熒光強度,結果顯示血清饑餓處理能顯著性增強細胞熒光強度,且隨著血清濃度增加,細胞熒光強度降低。表明THP-1細胞在血清不足的情況下,通過自噬來維持細胞的存活。自噬發生過程中,一些自噬相關基因(autophagy related gene,Atg)的表達對自噬調控有重要作用[12,13]。Atg5是參與形成自噬體的重要基因,對自噬發生起重要調節作用[14,15]。在自噬泡形成的早期階段,Atg5與Atg12和Atg16L形成復合物,促進了自噬泡的伸展和擴張;此外,Atg5復合物的形成還促進了LC3向自噬泡的移動[16]。本實驗Western blot結果顯示,血清饑餓處理能顯著增強Atg5的表達,表明血清饑餓能通過促進自噬體的形成促進自噬的進程。Atg7可誘導本底水平自噬發生,也可與Atg5-Atg12形成復合物,在自噬早期起決定性作用[17]。Atg7還參與催化LC3Ⅰ形成LC3Ⅱ,LC3Ⅱ是自噬體的標志分子,在自噬泡的形成中起重要作用[18,19]。結果顯示,血清饑餓能顯著增強Atg7和LC3Ⅱ的表達,表明血清饑餓可通過增強Atg7的表達來促進LC3Ⅰ形成LC3Ⅱ。本實驗也顯示,THP-1細胞具有本底水平的自噬發生,可能是細胞通過自噬來更新長壽命蛋白,去除受損的細胞器。

綜上所述,血清饑餓可顯著抑制人急性單核細胞白血病細胞株THP-1細胞增殖,增加細胞死亡率,誘導細胞發生自噬。血清誘導的自噬主要是通過調控自噬相關基因Atg5,Atg7和LC3Ⅱ表達來實現的。當THP-1細胞處于完全血清饑餓環境中,細胞自噬的發生不足以維持細胞生存或可以促進細胞死亡,當THP-1細胞處于低濃度血清或中濃度血清環境中,細胞自噬的發生可以維持細胞的存活。對急性髓細胞白血病中自噬發生機制的研究,可為白血病發病機制和靶向治療提供依據和新的研究方向。

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Effectsofserumdeprivationoncellproliferation,celldeathandautophagyinhumanleukemiacelllineTHP-1

GAO Xue, ZHENG Xiaoqi, LIU Weizhong, LIU Desheng, ZHANG Jing, PAN Xiaohong*

(CellEngineeringLaboratory,CollegeofPharmaceuticalSciences,BinzhouMedicalUniversity,Yantai264003,China;*Correspondingauthor,E-mail:panxiaohong@bzmc.edu.cn)

ObjectiveTo investigate the effects of serum deprivation on cell proliferation, cell death and autophagy in human monocytic leukemia cell line THP-1.MethodsExperiments were divided into four groups: 0% FBS group, 1% FBS group, 5% FBS and 10% FBS group(control group), and cells were starved for 24 h and 48 h. Cell proliferation was performed by MTT assay. Cell death was tested by trypan blue exclusion assay. Fluorescence intensity of acridine orange(AO) was examined by a flow cytometer. Western blot was performed for investigating the expression of autophagy-related genes at the protein level.ResultsThe serum deprivation significantly inhibited cell proliferation in a concentration-dependent and time-dependent manner after FBS treatment(P<0.05). And serum deprivation significantly increased cell death and the fluorescence intensity of acid autolysosome(P<0.05). Serum deprivation signifi cantly increased the expression of Atg5, Atg7 and LC3Ⅱ(P<0.05).ConclusionSerum deprivation can inhibit the cell proliferation, induce cell death and autophagy of THP-1 cells.

THP-1 cells; serum deprivation; cell proliferation; cell death; autophagy

Q279

A

1007-6611(2017)10-1003-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.10.006

國家自然科學基金資助項目(81573412，31270082);山東省自然科學基金資助項目(ZR2014JL055，ZR2013HM042);濱州醫學院科研啟動基金資助項目(BY2015KYQD03)

高雪,女,1985-01生,博士,講師,E-mail:gxue160304@bzmc.edu.cn

2017-07-31