miR-1202在宮頸癌組織中的表達及對HeLa細胞增殖及凋亡的影響

姚婷婷,張紅娜,高 婉,朱 康,段 釗

(西安交通大學第二附屬醫院婦產科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:duanzhao8@163.com)

miR-1202在宮頸癌組織中的表達及對HeLa細胞增殖及凋亡的影響

姚婷婷,張紅娜,高 婉,朱 康,段 釗*

(西安交通大學第二附屬醫院婦產科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:duanzhao8@163.com)

目的 探討miR-1202在宮頸癌組織中的表達及其對宮頸癌HeLa細胞增殖及凋亡的影響。 方法 采用實時定量PCR檢測29例宮頸癌組織及相對應的癌旁正常組織中miR-1202的表達;構建miR-1202過表達載體及合成miR-1202抑制劑,并轉染宮頸癌HeLa細胞;HeLa細胞被隨機分為4組:對照組(miR-control)、miR-1202過表達載體組(miR-1202)、miR-1202抑制劑陰性對照組(Inhibitor NC)、miR-1202抑制劑組(miR-1202 inhibitor);MTT法檢測miR-1202對宮頸癌細胞增殖的影響;流式細胞術分析miR-1202對細胞周期和凋亡的影響。 結果 miR-1202在宮頸癌組織中的表達顯著下調(P<0.01);miR-1202過表達載體組與miR-control組相比,OD值顯著降低(P<0.01),G1/G0期細胞數顯著增加(84.63%±5.08%;P<0.01),S期(11.56%±2.51%)和G2/M期(4.62%±1.75%)細胞數顯著減少(P<0.01),早期凋亡(19.68%±2.66%)和晚期凋亡(10.89%±1.94%)細胞數均顯著增加(P<0.01);而miR-1202 inhibitor組與Inhibitor NC組相比,OD值顯著升高(P<0.01),G1/G0期細胞數量顯著減少(43.68%±4.86%;P<0.01),S期(38.94%±2.86%)和G2/M期(18.65%±1.82%)細胞數量顯著增加(P<0.01),早期凋亡(2.06%±1.33%)和晚期凋亡(2.85%±1.22%)細胞數均顯著減少(P<0.01)。 結論 miR-1202在宮頸癌組織中下調,可抑制宮頸癌HeLa細胞的增殖,并誘導細胞凋亡。

miR-1202; 宮頸癌; 細胞增殖; 細胞周期; 細胞凋亡

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤,為女性癌癥死亡的首要原因,全球每年約30萬人死于宮頸癌[1],其發病率在女性癌癥中位于第2位,死亡率位于第5位[2]。近年來,宮頸癌的發病呈年輕化趨勢,嚴重威脅女性的健康。宮頸癌的發生發展是一個由多基因、多因素調控的多階段的極其復雜過程。目前關于宮頸癌的發病機制仍未完全闡明。研究表明核酸水平的調控與宮頸癌的發生發展關系密切,尤其是非編碼微小RNA(microRNA,miRNA)通過靶向調控其靶基因的表達影響宮頸癌發生發展。miRNA是一類長度為18-25個核苷酸、具有高度保守性的非編碼單鏈小分子RNA,它通過調節靶基因的表達,可參與細胞增殖、凋亡、分化、遷移和侵襲等生物學過程。miRNA通過與靶基因的mRNA的3′端非翻譯區互補性結合,抑制mRNA的翻譯或直接降解mRNA從而導致靶基因的表達下調[3]。近來的研究發現miR-1202可抑制膠質瘤細胞增殖[4],而miR-1202在宮頸癌發生發展中的作用尚未見報道。本研究分析miR-1202在宮頸癌組織中的表達變化及其對宮頸癌細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株及病理組織

人宮頸癌細胞系HeLa由西安交通大學第二附屬醫院轉化醫學中心提供。收集2016-01～2016-11西安交通大學第二附屬醫院外科手術切除的宮頸癌組織及相應的癌旁正常組織29例,手術后均經病理檢查確認,所有患者手術前均未經化療、放療等治療,收集樣本后置于液氮中長期保存。采集前經過醫院倫理委員會批準及患者知情同意。

1.2 主要儀器與試劑

CO2培養箱(英國RS Biotech公司);-80 ℃冰箱(日本SANYO公司);高通量微板測試系統(德國BMG Labtechnologies公司);流式細胞儀(美國FALS CALIBAR BD公司);實時定量PCR儀(美國Bio—Rad公司,iQ5 Multicolor)。RPMI 1640培養基(美國Gibco公司);新生胎牛血清(美國Gibico公司);MTT、RnaseA、碘化丙啶(美國Sigma公司);Annexin Ⅴ-FITC凋亡試劑盒(美國BD BioScience公司);Trizol和Lipofectamine2000(美國Invitogen公司);qRT-PCR試劑盒和逆轉錄試劑盒(大連TaKaRa公司)。

1.3 miR-1202過表達載體的構建及抑制劑的合成

在miRbase數據庫查找miR-1202的前體序列(MI0006334,5′-CCUGCUGCAGAGGUGCCAGCUGCAGUGGGGGAGGCACUGCCAGGGCUGCCCACUCUGCUUAGCCAGCAGGUGCCAAGAACAGG-3′),并在兩端構建EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點,該序列由上海生工生物工程有限公司合成。將該序列克隆到真核表達載體pcDNA6.2-GW/EmGFP中,然后由上海生工生物工程有限公司克隆、篩選、測序鑒定。miR-1202 inhibitor(5′-CUCCCCCACUGCAGCUGGCAC-3′)和miR-1202 inhibitor陰性對照(Inhibitor NC,5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′)由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 細胞培養與轉染

人宮頸癌細胞系HeLa細胞培養于含10%新生牛血清的RPMI 1640培養基,5% CO2,37 ℃培養,將對數生長期的HeLa細胞進行實驗。實驗分組為:pcDNA6.2空載體為對照組(miR-control)、miR-1202過表達載體組(miR-1202)、miR-1202抑制劑陰性對照組(Inhibitor NC)、miR-1202抑制劑組(miR-1202 inhibitor)。細胞在培養24 h時,各組依照Lipofectamine2000轉染說明書瞬時轉染。

1.5 實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)

在臨床宮頸癌樣本組織、癌旁正常組織、HeLa細胞中加入Trizol,用氯仿、異丙醇等提取總RNA。取1 μ1總RNA,分別加入特異性莖環引物(內參U6-RT:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′;miR-1202-RT:5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACGG GGGAG-3′),依照試劑盒說明書操作逆轉錄cDNA,反應溫度:42 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。qRT-PCR反應,按照序列設計引物。內參U6引物Forward: 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,U6引物Reverse: 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′;miR-1202引物Forward: 5′-ATCCAGTGCGT GTCGTG-3′,Reverse: 5′-TGCTGTGCCAGCTGCAGT-3′。擴增條件:95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40個循環,72 ℃延伸5 min終止反應。所有樣品均設立3個復孔,并用2-ΔΔCt法對結果進行相對定量分析。

1.6 MTT法檢測HeLa細胞增殖

HeLa細胞以4 000個/孔接種于96孔板,培養基為200 μl/孔。每組4個復孔,轉染miR-1202過表達載體和抑制劑后培養24,48,72 h,每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl,再培養4 h,棄上清液,加入150 μl DMSO,震蕩,用微板測試儀檢測光吸收值,波長為490 nm。

1.7 流式細胞儀檢測HeLa細胞周期

轉染48 h時收集細胞,每組3個復孔,用預冷的PBS洗滌3次,75 %乙醇過夜固定;加濃度為100 μg/ml碘化丙啶(PI)染液0.3 ml,室溫靜置15 min;流式細胞儀檢測,激發波長是488 nm,PI的紅色熒光通過630 nm的濾光片進行信號收集,利用Modfit LT軟件分析DNA含量變化,并分析細胞周期變化。

1.8 流式細胞儀檢測HeLa細胞凋亡

收集轉染48 h的細胞,每組3個復孔,用預冷的PBS洗滌3次。500 μl結合緩沖液懸浮細胞,加入5 μl Annexin Ⅴ/FITC和5 μl 20 μg/ml的PI,混勻,室溫靜置15 min。流式細胞儀檢測,FITC發綠色熒光,PI受激發后發紅色熒光,檢測結果用隨機軟件進行分析。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 miR-1202在宮頸癌組織中的表達

采用qRT-PCR檢測29對宮頸癌組織及癌旁正常組織miR-1202的表達變化。結果顯示,與癌旁正常組織相比,miR-1202在宮頸癌組織中表達顯著下調(P<0.01),平均下調至正常組織的0.61倍(見圖1)。

圖1 miR-1202在宮頸癌組織中表達Figure 1 The miR-1202 expression in cervical cancer tissues

2.2 miR-1202對宮頸癌HeLa細胞增殖的影響

在宮頸癌細胞系HeLa細胞中分別轉染空載體(miR-control)、miR-1202過表達載體(miR-1202)、抑制劑陰性對照(Inhibitor NC)、miR-1202抑制劑(miR-1202 inhibitor),并在轉染24 h時通過qRT-PCR檢測miR-1202表達。結果顯示,與miR-control組相比,miR-1202過表達載體組miR-1202表達顯著上調(P<0.01),上調至36.8倍;而轉染抑制劑后miR-1202表達無顯著變化(見表1)。MTT法分析miR-1202對宮頸癌細胞系HeLa細胞增殖能力的影響。結果表明,與miR-control組相比,轉染miR-1202過表達載體48,72 h時OD值(0.498±0.045,0.685±0.062)均顯著降低(P<0.01);與Inhibitor NC組相比,轉染miR-1202 inhibitor 48,72 h時OD值(0.806±0.058,1.201±0.073)均顯著升高(P<0.01，見圖2),說明miR-1202可抑制宮頸癌細胞系HeLa細胞增殖。

組別 miR-1202表達P* miR-control組1 miR-1202組36.82±2.110.001 InhibitorNC組1 miR-1202inhibitor組0.93±0.100.873

*與上一組比較P值

與miR-control組相比,*P<0.01;與inhibitor NC組相比,#P<0.01圖2 MTT比色分析miR-1202對HeLa細胞增殖的影響Figure 2 Effect of miR-1202 on the HeLa cell proliferation by MTT assay

2.3 miR-1202對宮頸癌HeLa細胞周期的影響

在HeLa細胞中分別轉染miR-1202過表達載體和miR-1202 Inhibitor 48 h時,收集細胞分散為單細胞懸液,流式細胞儀檢測細胞周期。miR-1202過表達載體組與miR-control組相比,G1/G0期細胞數量顯著增加(84.63%±5.08%,P<0.01),而S期細胞數量顯著減少(11.56%±2.51%,P<0.01),G2/M期細胞數量也顯著減少(4.62%±1.75%,P<0.01);miR-1202 Inhibitor組與Inhibitor NC組相比,G1/G0期細胞數量顯著減少(43.68%±4.86%,P<0.01),S期細胞數量顯著增加(38.94%±2.86%,P<0.01),G2/M期細胞數量也顯著增加(18.65%±1.82%,P<0.01,見圖3)。結果證明miR-1202可使宮頸癌HeLa細胞阻滯在G0/G1期,從而抑制細胞進入S和G2/M期進行增殖。

與miR-control組相比,*P<0.01;與Inhibitor NC組相比,#P<0.01圖3 miR-1202對HeLa細胞周期的影響Figure 3 Effect of miR-1202 on the cell cycle of HeLa cells

2.4 miR-1202對宮頸癌HeLa細胞凋亡的影響

HeLa細胞分別轉染miR-1202過表達載體和miR-1202 Inhibitor 48 h時,收獲細胞制備單細胞懸液,采用Annexin Ⅴ+PI試劑盒染色,流式細胞儀檢測分析。與miR-control組相比,miR-1202過表達載體組早期凋亡細胞顯著增加(19.68%±2.66%,P<0.01),晚期凋亡細胞也增加(10.89%±1.94%,P<0.01);與Inhibitor NC組相比,miR-1202 Inhibitor組早期凋亡細胞顯著減少(2.06%±1.33%,P<0.05),晚期凋亡細胞也減少(2.85%±1.22%,P<0.01,見圖4)。這表明miR-1202可誘導宮頸癌HeLa細胞凋亡。

與miR-control組相比,*P<0.01;與Inhibitor NC組相比,#P<0.01圖4 miR-1202對HeLa細胞凋亡的影響Figure 4 Effect of miR-1202 on the apoptosis of HeLa cells

3 討論

在宮頸癌的研究中發現,多種miRNA的表達異常與宮頸癌的發生、發展以及預后等關系密切,例如,miR-182、miR-21、miR-361-5p和miR-92等在宮頸癌中高表達,發揮癌基因的作用[5,6];而miR-101和miR-7等miRNA在宮頸癌中的表達明顯下調,發揮抑癌基因的作用[7]。研究報道,miR-7可通過靶向調控環氧合酶2和X連鎖凋亡抑制蛋白等基因的表達抑制宮頸癌細胞的增殖、侵襲及遷移,并誘導凋亡[7]。下調miR-21可通過上調CCL20抑制細胞增殖、遷移,促進凋亡,并抑制裸鼠宮頸癌皮下移植瘤的生長;而過表達miR-21可通過抑制PTEN來促進宮頸癌細胞的增殖及遷移[8]。近來的研究發現miR-1202參與了幾種腫瘤的發生發展,但是miR-1202在不同腫瘤中的表達變化并不相同,其原因可能是在不同腫瘤中的作用機制不同。例如,miR-1202在卵巢癌、膠質瘤和透明細胞乳頭狀腎細胞癌中表達下調[4,9,10],而在子宮內膜癌、乳腺癌、胃癌、腎上腺皮質癌和甲狀腺乳頭狀癌中表達上調[11-14]。本研究結果表明,miR-1202在宮頸癌中的表達顯著減少,提示其可能在宮頸癌的發生發展中發揮抑制作用。

miR-1202的生物學功能中,主要涉及的是調節腫瘤細胞增殖與凋亡的功能。在不同腫瘤的發生發展過程中,miR-1202可能作為癌基因存在,也可能作為抑癌基因發揮功能。Quan等[4]發現miR-1202在膠質瘤中通過靶向調控Rab1A誘導內質網應激和凋亡,并抑制膠質瘤細胞增殖。?zata等[13]研究表明高表達的miR-1202與腎上腺皮質癌的生存率密切相關。Wang等[14]報道高表達的miR-1202與腎上腺皮質癌的淋巴結轉移相關。本研究表明,miR-1202可抑制宮頸癌HeLa細胞增殖,使宮頸癌細胞阻滯在G0/G1期,并誘導凋亡。

綜上所述,miR-1202在宮頸癌組織中表達顯著下調,抑制宮頸癌細胞的增殖,阻斷細胞周期,并誘導細胞凋亡,由此可見miR-1202在宮頸癌中起著抑癌基因的作用。這將為尋找宮頸癌新的分子治療靶標提供實驗依據,但是miR-1202在宮頸癌發生發展過程中的分子作用機制有待于進一步探索。

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山西醫科大學第二醫學院 張秦風

ExpressionofmiR-1202incervicalcancertissuesanditseffectonproliferationandapoptosisofHeLacells

YAO Tingting, ZHANG Hongna, GAO Wan, ZHU Kang, DUAN Zhao*

(DepartmentofObstetricsandGynecology,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China;*Correspondingauthor,E-mail:duanzhao8@163.com)

ObjectiveTo investigate the expression of miR-1202 in human cervical cancer tissues and its effects on proliferation and apoptosis of HeLa cells.MethodsThe qRT-PCR was used to detect the expression of miR-1202 in 29 cases of cervical cancer samples and control tissues. MiR-1202 overexpression vector was constructed. MiR-1202 inhibitor was synthesized. MiR-1202 overexpression vector and miR-1202 inhibitor were transfected into HeLa cells. HeLa cells were divided into four groups: control group(miR-control), miR-1202 overexpression vector group(miR-1202),miR-1202 inhibitor negative control group(inhibitor NC) and miR-1202 inhibitor group(miR-1202 inhibitor). MTT assay was used to analyze the effects of miR-1202 on proliferation of cervical cancer HeLa cells. The effects of miR-1202 on the cell cycle and apoptosis of cervical cancer HeLa cells were observed by flow cytometer.ResultsThe expression of miR-1202 significantly down-regulated in cervical cancer tissues(P<0.01). Compared with miR-control, miR-1202 overexpression vector decreased the OD value(P<0.01), increased the proportion of G1/G0phase cells(84.63%±5.08%,P<0.01), reduced the proportion of S and G2/M phase cells (11.56%±2.51% and 4.62%±1.75%,P<0.01), and increased the proportion of early apoptosis and late apoptosis (19.68%±2.66% and 10.89%±1.94%,P<0.01). Compared with inhibitor NC, miR-1202 inhibitor increased the OD value(P<0.01), diminished the proportion of G1/G0phase cells (43.68%±4.86%,P<0.01), increased the proportion of S and G2/M phase cells (38.94%±2.86% and 18.65%±1.82%,P<0.01), and reduced the proportion of early apoptosis and late apoptosis(2.06%±1.33% and 2.85%±1.22%,P<0.01).ConclusionThe expression of miR-1202 decreases in cervical cancer tissues, and it can inhibit the proliferation of cervical cancer cells and induce the apoptosis.

miR-1202; cervical cancer; cell proliferation; cell cycle; cell apoptosis

R737.33

A

1007-6611(2017)10-1008-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.10.007

陜西省自然科學基金資助項目(2013JM4012)

姚婷婷,女,1987-04生,在讀碩士,住院醫師,E-mail:yaott415@sina.com

2017-06-09