MTH1抑制劑TH588對人乳腺癌細胞增殖及相關蛋白表達的影響

李 璐,張 配,趙素容,李其響,潘 瓊,王先知,王仲崑,劉 浩

(蚌埠醫學院藥學院,安徽省生化藥物工程技術研究中心,蚌埠 233030;*通訊作者,E-mail:liuhao6886@foxmail.com)

MTH1抑制劑TH588對人乳腺癌細胞增殖及相關蛋白表達的影響

李 璐,張 配,趙素容,李其響,潘 瓊,王先知,王仲崑,劉 浩*

(蚌埠醫學院藥學院,安徽省生化藥物工程技術研究中心,蚌埠 233030;*通訊作者,E-mail:liuhao6886@foxmail.com)

目的 觀察MTH1抑制劑TH588對人乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231細胞增殖的影響,探討其作用機制。 方法 MTT法檢測不同濃度的TH588(0,8,16,32,64,128 μmol/L)對乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231細胞增殖的抑制作用,倒置顯微鏡觀察TH588處理乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231細胞后細胞形態學變化。集落克隆形成抑制實驗觀察不同濃度的TH588(0,3.2,6.4,12.8 μmol/L)對乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231細胞增殖的抑制作用。PI單染流式細胞術檢測不同濃度TH588(0,32,64,128 μmol/L)對乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231細胞死亡的影響,Western blot檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax的表達。 結果 在128 μmol/L的TH588作用下,MCF-7細胞24,48,72 h的存活率分別為(67.32±4.34)%、(56.81±0.93)%和(30.86±1.46)%,MDA-MB-231細胞24,48,72 h的存活率分別為(63.35±0.49)%、(41.11±0.75)%和(29.15±0.85)%,與對照組(0 μmol/L)比較,細胞的存活率明顯降低(P<0.05)。在倒置顯微鏡下可觀察到TH588作用于乳腺癌細胞后,細胞數目明顯減少,細胞形態發生改變,細胞皺縮,有細胞碎片及顆粒物質形成,細胞邊緣不清晰。集落克隆實驗結果表明,TH588對乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞有明顯的增殖抑制作用。PI結果顯示,128 μmol/L TH588處理MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞48 h,細胞死亡率分別為52.8%和55.6%,與對照組相比細胞死亡率明顯增高(P<0.05)。Western blot結果顯示,TH588可下調Bcl-2蛋白的表達,并上調Bax蛋白的表達。 結論 TH588對乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞有明顯的增殖抑制作用,其機制可能是TH588抑制了MTH1的修復作用,激活Bax和抑制Bcl-2,從而引起乳腺癌細胞的凋亡。

乳腺癌; TH588; MTH1; 活性氧

乳腺癌是威脅女性健康與生活質量最常見的惡性腫瘤之一。腫瘤流行病學數據顯示,2012年全球新確診乳腺癌167萬例,死亡52萬例[1]。近年來,我國乳腺癌發病增長速度超全球2倍,成為女性發病率最高的癌癥[2]。

目前乳腺癌靶向藥物治療主要是針對特定的致癌基因及其相關通路進行治療的,由于基因的多態性和腫瘤內部高度的異質性,以及基因相互作用網絡的復雜性,針對致癌基因以及缺陷基因的治療效果受到較大的限制。2014年提出了“cancer phenotypic lethality”的概念,即由于腫瘤細胞的共性,某些途徑的功能性蛋白成為腫瘤細胞所必需的,并在腫瘤細胞中高表達。而在正常細胞中,由于非必需而表達量低甚至不表達。因此針對此種途徑進行的治療,對腫瘤細胞有效而對正常細胞影響較小,并且與腫瘤的基因型和腫瘤異質性無關,具有廣泛的應用前景[3]。

MTH1基因是維持腫瘤增殖、存活以及促進腫瘤轉移的關鍵基因,在多種腫瘤細胞中都有高表達[4-6]。MTH1酶能夠保護腫瘤細胞,修復活性氧(reactive oxygen species,ROS)造成的損傷[7],而ROS在多種腫瘤中具有較高的水平[8,9]。而MTH1對于正常細胞是非必需的[10]。MTH1可能是不同類型的癌癥細胞存活所必需的,對MTH1途徑進行抑制,極有可能是治療乳腺癌的新方向。本研究旨在觀察MTH1抑制劑TH588對不同乳腺癌細胞的增殖抑制作用,探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

人乳腺癌細胞株MCF-7和MDA-MB-231,購自中國科院上海生物細胞研究所,蚌埠醫學院生化藥理研究室凍存。DMEM培養基、胰蛋白酶、胎牛血清購自美國Gibco公司,噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)購自美國Sigma公司,Bcl-2、Bax、β-actin抗體購自英國Abcam公司,TH588購于美國Selleck公司。

1.2 細胞培養

乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞培養于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養基中,37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養。

1.3 MTT法檢測細胞增殖

取對數生長期的MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞,用0.25%胰蛋白酶消化,制備成單細胞懸液,每孔加100 μl含有MCF-7(5×103/孔)和MDA-MB-231(1×104/孔)細胞的培養液接種于96孔板,在培養箱培養24 h,待細胞充分貼壁,棄去每孔的培養液,加入含有不同濃度(0,8,16,32,64,128 μmol/L)的TH588的培養液,設置調零孔,每組設5個復孔,分別培養24,48,72 h,每孔加入15 μl MTT溶液,繼續培養4 h,棄上清液,每孔加入150 μl DMSO,37 ℃溫箱孵育30 min,酶標儀測定490 nm波長下各孔的吸光度(OD)值,計算細胞的存活率:細胞存活率(%)=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.4 倒置顯微鏡觀察細胞形態

將對數生長期的乳腺癌細胞制成單細胞懸液,以5×105/孔的密度接種MCF-7和MDA-MB-231細胞于6孔板中。將細胞放在培養箱中培養24 h,加入不同濃度梯度的TH588,作用48 h用倒置顯微鏡觀察乳腺癌細胞形態。

1.5 集落克隆形成抑制實驗

1.6 PI單染檢測細胞死亡率

1.7 Western blot檢測蛋白表達

將乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞接種于60 mm培養皿中,每個培養皿加入3 ml含有7×105個MCF-7和MDA-MB-231細胞的新鮮培養液,在培養箱中培養24 h,更換含有不同濃度(0，32，64，128 μmol/L)TH588的培養液,繼續培養24 h,收集細胞。加入適量預冷的RIPA蛋白裂解液,冰上裂解30 min,提取細胞總蛋白。BCA蛋白定量法(參照試劑盒說明書操作)測定各組蛋白濃度。用細胞裂解液將各組蛋白稀釋至等濃度,與2×上樣緩沖液1 ∶1混合,95 ℃煮沸5 min使蛋白變性。每組取40 μg蛋白進行12% SDS-PAGE電泳,轉膜至PVDF膜,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,TPBS洗膜3次,一抗4 ℃過夜,TPBS洗膜3次;二抗室溫孵育2 h,TPBS洗膜3次,ECL試劑盒顯影,Bio-Rad凝膠成像系統對膜進行曝光獲取圖像。

1.8 統計學分析

采用SPSS16.0軟件對實驗結果進行分析,實驗數據均以均數±標準差表示,各組間差異采用單因素方差分析和LSD檢驗比較組間差異,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TH588對乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞的增殖抑制作用

MTT檢測結果表明,隨著TH588濃度的增加和作用時間的延長,TH588對人乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231細胞的增殖抑制作用增加(見圖1)。128 μmol/L的TH588處理乳腺癌細胞24,48,72 h,MCF-7細胞的存活率分別為(67.32±4.34)%,(56.81±0.93)%和(30.86±1.46)%,MDA-MB-231細胞的存活率分別為(63.35±0.49)%,(41.11±0.75)%和(29.15±0.85)%,與對照組比較均具有統計學差異(P<0.05)。

同時點與0 μmol/L比較，*P<0.05圖1 TH588對MCF-7和MAD-MB-231細胞存活率的影響Figure 1 Changes of the viability of MCF-7 and MDA-MB-231 cells after treated with TH588 for different time

2.2 TH588對乳腺癌細胞形態的影響

不同濃度的TH588作用于乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞48 h,在鏡下可見,對照組細胞貼壁生長旺盛,細胞間鏈接緊密,細胞呈圓形,胞膜清楚,胞質飽滿,實驗組細胞密度減低,懸浮細胞增多,細胞間隙增寬,細胞皺縮,有細胞碎片及顆粒物質形成,細胞邊緣不清晰,失去了正常細胞形態(見圖2)。

2.3 TH588對乳腺癌細胞集落克隆形成的抑制作用

為了進一步觀察TH588對乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞增殖的抑制作用,實驗中用3.2，6.4，12.8 μmol/L的TH588作用于兩株細胞。結果表明,與對照組比較TH588在較低濃度即可抑制乳腺癌MCF-7(圖3A)和MDA-MB-231(圖3B)細胞集落克隆的形成,并隨著濃度增加克隆數目逐漸減少(見圖3)。

2.4 PI單染實驗檢測細胞的死亡率

PI單染結果顯示,32，64，128 μmol/L TH588作用于乳腺癌細胞48 h,與對照組比較,MCF-7和MDA-MB-231細胞的死亡率明顯增加(見圖4),128 μmol/L的TH588作用于兩株細胞,MCF-7的死亡率達到52.8%,MDA-MB-231的死亡率達到55.6%,與對照組(MCF-7 1.9%,MDA-MB-231 2.3%)相比,細胞死亡率明顯增加,差異均具有統計學意義(P<0.05)。

圖2 TH588對MCF-7和MDA-MB-231細胞形態的影響Figure 2 Effects of TH588 on the morphology of MCF-7 and MDA-MB-231 cells

A.MCF-7細胞 B.MDA-MB-231細胞a.0 μmol/L TH588;b.3.2 μmol/L TH588;c.6.4 μmol/L TH588;d.12.8 μmol/L TH588圖3 TH588對乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞的集落抑制作用Figure 3 TH588 inhibits colony formation in breast cancer MCF-7 and MDA-MB-231 cells

2.5 Western blot檢測相關凋亡蛋白的表達

Western blot結果表明,32,64,128 μmol/L TH588作用于乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞24 h,Bcl-2蛋白的表達明顯下降,而Bax蛋白的表達增加(見圖5)。

3 討論

TH588屬于nudix水解酶家族抑制劑,能選擇性地參與抑制MTH1的蛋白表達。MTH1基因定位于人第7號染色體p22上[11],可以保護DNA免受氧自由基(ROS)的損傷,對腫瘤細胞的生存是非常重要的[12]。包括乳腺癌在內的多種腫瘤組織的發生發展過程中均出現了MTH1蛋白的異常表達,如胃癌[13]、結腸癌[14]、肺癌[15]及卵巢癌[16]等,MTH1在上述腫瘤組織中均參與了保護腫瘤細胞DNA增殖、凋亡、遷移的過程。

由于腫瘤具有高度的異質性,基因表型不一致,目前臨床上適用于靶向藥物的人群較少。MTH1基因是維持腫瘤細胞生存所必需的,且對于正常細胞的作用較為局限,所以通過藥物抑制MTH1基因的表達既能起到抑制腫瘤細胞增殖的作用,而對正常的細胞損傷很小,對多數腫瘤的治療具有適用性。故MTH1基因是一個較為理想的治療靶點。本研究證實,MTH1抑制劑TH588對乳腺癌細胞具有明顯的增殖抑制和誘導凋亡的作用,克服了腫瘤基因表型異質性帶來的靶向治療的困境,對“三陰性”乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖抑制作用仍較明顯。

圖4 TH588對MCF-7和MDA-MB-231細胞死亡的影響Figure 4 Effects of TH588 on death of MCF-7 and MDA-MB-231 cells

圖5 TH588對MCF-7和MDA-MB-231細胞蛋白表達的影響Figure 5 Effects of TH588 on protein expression of MCF-7 and MDA-MB-231 cells

細胞凋亡是由基因控制的細胞自主的有序的死亡形式,是多基因嚴格控制的過程,這些基因包括如抑癌基因p53、caspase家族、Bcl-2家族等。Bcl-2家族有眾多成員,如Mcl-1、NR-B、A1、Bcl-w、Bcl-x、Bax、Bak、Bad、Bim等[17]。Bcl-2屬于促細胞存活的蛋白,生理功能是能夠抑制多種類型的細胞凋亡,延長細胞壽命,其中也包括腫瘤細胞,Bcl-2通過阻止線粒體細胞色素C的釋放而發揮抗凋亡作用。Bcl-2家族中被研究最廣泛的Bax具有促進細胞凋亡的作用,當誘導凋亡時,Bax從胞液遷移到線粒體和核膜。Bax激活也可直接或間接地鈍化抑制凋亡的Bcl-2蛋白[18]。本研究通過Western blot法檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達,隨著TH588濃度的增加,乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞Bax的表達增多,Bcl-2蛋白表達減少,推測可能當MTH1被TH588抑制后,ROS在腫瘤細胞內積聚,ROS激活Bax蛋白的表達,下調Bcl-2蛋白,參與促進乳腺癌細胞凋亡的過程,從而導致腫瘤細胞的增殖抑制和死亡。

綜上所述,本實驗證明了MTH1的抑制劑TH588可以明顯地抑制乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞的生長,具有抗腫瘤作用,其機制可能是TH588抑制MTH1后,腫瘤細胞內異常的能量代謝產生的ROS激活Bax蛋白和抑制Bcl-2蛋白的表達,從而導致腫瘤細胞的增殖抑制和死亡。

[1] Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R,etal. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J]. Int J Cancer, 2015, 136(5):E359-386.

[2] Fan L, Strasserweippl K, Li JJ,etal. Breast cancer in China[J]. Lancet Oncol, 2014, 15(7):e279-289.

[3] Wang JY, Jin L, Yan XG,etal. Reactive oxygen species dictate the apoptotic response of melanoma cells to TH588[J]. J Invest Dermatol, 2016, 136(11):2277-2286.

[4] Patel A, Burton DG, Halvorsen K,etal. MutT Homolog 1 (MTH1) maintains multiple KRAS-driven pro-malignant pathways[J]. Oncogene, 2015, 34(20):2586-2596.

[5] Speina E, Arczewska KD, Gackowski D,etal. Contribution of hMTH1 to the maintenance of 8-oxoguanine levels in lung DNA of non-small-cell lung cancer patients[J]. J Natl Cancer Inst, 2005, 97(5):384-395.

[6] Borrego S, Vazquez A, Dasí F,etal. Oxidative stress and DNA damage in human gastric carcinoma: 8-Oxo-7′8-dihydro-2′-deoxyguanosine (8-oxo-dG) as a possible tumor marker[J]. Int J Mol Sci, 2013, 14(2):3467-3486.

[7] Gad H, Koolmeister T, Jemth AS,etal. Corrigendum: MTH1 inhibition eradicates cancer by preventing sanitation of the dNTP pool[J]. Nature, 2017, 544(7651):508.

[8] Kim HS, Jung G. Notch1 increases Snail expression under high reactive oxygen species conditions in hepatocellular carcinoma cells[J]. Free Radic Res, 2014, 48(7):806-813.

[9] Yiping Q, Siwen D, Peng H. Gene methylation in gastric cancer[J]. Clin Chim Acta, 2013, 424:53-65.

[10] Tsuzuki T, Egashira A, Kura S. Analysis of MTH1, gene function in mice with targeted mutagenesis[J]. Mutat Res, 2001, 477(1-2):71-78.

[11] Sakai Y, Oda H, Yoshimura D,etal. The GT to GC single nucleotide polymorphism at the beginning of an alternative exon2C of human MTH1 gene confers an amino terminal extension that functions as a mitochondrial targeting signal[J]. J Mol Med (Berl), 2006, 84(8):660-670.

[12] Rai P. Oxidation in the nucleotide pool, the DNA damage responseand cellular senescence: Defective bricks build adefectivehouse[J]. Mutat Res, 2010, 703(1):71-81.

[13] Borrego S, Vazquez A, Dasi F,etal. Oxidative stress and DNA damage in human gastric carcinoma: 8-Oxo-7′8-dihydro-2′-deoxyguanosine (8-oxo-dG) as a possible tumor marker[J]. Int J Mol Sci, 2013, 14(2)3467-3486.

[14] Qiu Y, Zhang H, Sun LH,etal. Hypoxia-inducible factor-1modulates upregulation of mutT homolog-1 in colorectalcancer[J]. World J Gastroenterol, 2015, 21(48):13447-13456.

[15] Niu Y, Pan D, Shi D,etal. Influence of chirality of crizotinib onIts MTH1 protein inhibitory activity: insight from molecular dynamics simulations and binding free energy calculations[J]. PLoS One, 2015, 10(12):e0145219.

[16] Tao G, Gu S, Liu F,etal. Investigation of MTH1 activity via, mismatch-based DNA chain elongation[J]. Analytica Chimica Acta, 2016, 905:66-71..

[17] Jung JI, Chung E, Mi RS,etal. Isoliquiritigenin (ISL) inhibits ErbB3 signaling in prostate cancer cells[J]. Biofactors, 2006, 28(3-4):159-168.

[18] Rosse T, Olivier R, Monney L,etal. Bcl-2 prolongs cell survival after Bax-induced release of cytochrome c.[J]. Nature, 1998, 391(6666):496-499.

LI Lu, ZHANG Pei, ZHAO Surong, LI Qixiang, PAN Qiong, WANG Xianzhi, WANG Zhongkun, LIU Hao*

(SchoolofPharmacy,BengbuMedicalCollege,AnhuiEngineeringTechnologyResearchCenterofBiochemicalPharmaceuticals,Bengbu233030,China;*Correspondingauthor,E-mail:liuhao6886@foxmail.com)

ObjectiveTo investigate the effect of MTH1 inhibitor TH588 on the proliferation of human breast cancer cells and explore its possible mechanism.MethodsMTT assay was used to detect the viability of breast cancer MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells after exposed to different concentrations(0, 8, 16, 32, 64, 128 μmol/L) of TH588, and the morphological changes of MCF-7 and MDA-MB-231 cells were observed under inverted microscope. The colony formation assay was used to detect the viability of breast cancer MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells after exposed to different concentrations(0, 3.2, 6.4, 12.8 μmol/L) of TH588. After the breast cancer MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells were treated with different concentrations of TH588(0, 32, 64, 128 μmol/L), the cell death rate was analyzed by flow cytometry with PI staining, and the expression of Bcl-2 and Bax protein was analyzed by Western blot.ResultsThe MCF-7 cells survival rates were (67.32±4.34)%,(56.81±0.93)% and(30.86±1.46)% after exposed to 128 μmol/L TH588 for 24, 48, 72 h,respectively, and the MDA-MB-231 cells survival rates were (63.35 ± 0.49)%, (41.11 ± 0.75)% and (29.15 ± 0.85)%, respectively. Compared with control group(0 μmol/L), the survival rates of MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells were significantly decreased(P<0.05). Under inverted microscope, the numbers of breast cancer MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells were significantly reduced after treated with TH588, cell morphology changed, cells were shrinked, cells debris and particulate matter formation appeared, and the cell edges were not clear. PI staining results showed that the mortalities of MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells treated with 128 μmol/L TH588 for 48 h were 52.8% and 55.6%, which were significantly higher than those treated with 0 μmol/L TH588(P<0.05). The results of Western blot showed that TH588 down-regulated the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2, and up-regulated the expression of proapoptotic protein Bax in MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells.ConclusionTH588 may cause apoptosis of breast cancer cells by inhibiting the repair of MTH1，activating Bax and inhibiting Bcl-2.

breast cancer; TH588; MTH1; reactive oxygen species

R737.9

A

1007-6611(2017)10-1013-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.10.008

國家自然科學基金資助項目(81372899,81603155);安徽省高等學校省級自然科學研究項目重大項目(KJ2016SD39);安徽省國際合作交流項目(1503062024);安徽省高校自然科學研究重點項目(KJ2016A486)

李璐,女,1986-09生,在讀碩士,E-mail:408988394@qq.com

2017-07-18

EffectsofMTH1inhibitorTH588onproliferationandrelatedproteinsexpressioninhumanbreastcancercells