TLR4基因單核苷酸多態性與軍團菌感染的體外實驗研究

張 帆，祁 琨，姚 紅

(1山西醫科大學微生物學與免疫學教研室,太原 030001；2山西醫科大學第一醫院老年病科；*通訊作者,E-mail:zhangfan11688@126.com)

TLR4基因單核苷酸多態性與軍團菌感染的體外實驗研究

張 帆1*，祁 琨2，姚 紅1

(1山西醫科大學微生物學與免疫學教研室,太原 030001；2山西醫科大學第一醫院老年病科；*通訊作者,E-mail:zhangfan11688@126.com)

目的 從體外實驗探討TLR4基因單核苷酸多態性TLR4(2244G→A)、(2299A→G)和(2242T→C)與軍團菌感染的關系。 方法 用軍團菌刺激健康人(n=54)外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，real-time RT-PCR檢測PBMC中TLR4及MyD88的表達水平，ELISA法檢測培養上清液中IL-1β、IL-6及TNF-α的水平，采用SNaPshot技術對TLR4多態性(2244G→A)、(2299A→G)和(2242T→C)進行分型檢測。 結果 體外實驗顯示TLR4(2244G→A)AA型TNF-α表達顯著高于GG/GA型(P=0.036 7)，然而GG/GA型MyD88、IL-6的水平顯著高于AA型(P=0.035 2，P=0.031 7)。但是TLR4(A2299G)及TLR4(T2242C)各種基因型之間TNF-α、IL-6、IL-1β及TLR4、MyD88的表達均無差異(P>0.05)。 結論 TLR4基因單核苷酸多態性與軍團菌感染的宿主易感性可能無關。

基因多態性； Toll樣受體； 軍團菌； 細胞因子

單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)是一類進化保守的胚系編碼的模式識別受體(PRR),可以識別并結合不同的細菌或病毒的分子結構,啟動機體的天然免疫反應。國內外學者研究表明人TLR4基因(Asp299Gly和Thr399Ile)多態性可能與多種感染疾病易感性及發展和預后相關。TLR4(Asp299Gly,Thr399Ile)基因的單核苷酸多態性與多種感染性疾病包括膿毒癥、肺炎球菌病、腦膜炎等關系密切[1-4];Hawn等[5]對荷蘭一次暴發的軍團菌病進行了研究,比較病例組與對照組TLR4等位基因頻率和基因型頻率,發現TLR4 Asp299Gly和Thr399Ile都與軍團菌病的易感性有關,而且TLR4 896G及1196T均為軍團菌感染的保護性基因,擁有這2個SNP的個體能抵抗軍團菌感染。

由于基因多態性在不同人群和地域的分布頻率不同,TLR4編碼區的Asp299Gly(D299G)和Thr399 Ile(T399I)單核苷酸多態性位點在中國人群突變頻率比較低。馮凱等[6]和王永堂[7]研究發現在我國漢族人群TLR4基因多態性有以下3個位于5′調控區的新的高頻分布SNP:即TLR4(2244G→A)、TLR4(2299A→G)及TLR4(2242T→C)。目前關于TLR4的這3個SNP基因多態性與軍團菌感染易感性尚未見研究。本研究通過體外實驗觀察TLR4(2244G→A)、(2299A→G)和(2242T→C)與軍團菌感染的關系,分析TLR4不同基因型對髓樣分化因子88(MyD88)mRNA,TLR4 mRNA和TNF-α、IL-1β、IL-6表達的影響，初步闡明我國漢族人群TLR4基因多態性與軍團菌感染易感性的發生機制。

1 材料與方法

1.1 材料

由太原市紅十字血液中心取健康人(n=54)外周血,采用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC);嗜肺軍團菌血清1型(Legionella pneumophila subsp)ATCC 33152,購自美國標準菌種保藏所(American Type Culture Collection,ATCC)。

1.2 試劑

軍團菌BCYE培養基(英國OXIOD公司);人淋巴細胞分離液(美國sigma公司);改良型RPMI 1640培養基(美國Thermo公司);標準胎牛血清:杭州四季青生物工程材料有限公司;RNAisoTMPlus總RNA提取試劑(TaKaRa D9108A寶生物大連有限公司);RT-PCR一步法試劑盒(TaKaRa DRRO86A寶生物大連有限公司);TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒(北京四正柏生物技術有限公司)。

1.3 軍團菌刺激外周血PBMC

1.4 用real-time RT-PCR法檢測細胞TLR4及MyD88表達水平

將收獲的細胞按照RNAisoTMPlus試劑盒說明提取總RNA,TLR4,MyD88的RT-PCR引物由寶生物工程(大連)有限公司設計合成,其序列見表1。

表1TLR4、MyD88及內參照β-actin引物序列

Table1TheprimersequenceofTLR4,MyD88andinternalreferencebeta-actin

名稱引物序列產物(bp)TLR4上游:5'-TTCAGAACTTCAGTGGCTGGATT-TA-3'177下游:5'-GTCTCCACAGCCACCAGATTCTC-3'MyD88上游:5'-AAGATGACCCTGGGAGCCCTA-3'131下游:5'-GCTCAGGCCAGTCATCATTGAA-3'β-actin上游:5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3'150下游:5'-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3'

取2 μl RNA樣本進行real time RT-PCR,反轉錄反應條件為42 ℃,5 min;95 ℃,10 s。PCR反應條件為95 ℃,5 s;60 ℃,30 s;循環40次,所有循環結束后,繪制融解曲線判斷擴增產物的特異性。熒光信號由本底進入指數增長階段達到熒光閾值所對應的循環數稱為Ct值。Ct值可以反映每個樣品內表達量的多少,用CtmRNA/Ctβ-actin反映每個樣品中mRNA的相對表達水平,此值越大,表示其mRNA表達越少。

1.5 ELISA法檢測上清液細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α

軍團菌刺激PBMC 24 h后培養上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度遵照ELISA試劑盒的方法檢測。

1.6 采用SNaPshot技術進行TLR4 SNP分型檢測

SNaPshot技術是由美國應用生物公司(ABI)開發,基于熒光標記單堿基延伸原理的分型技術,也稱小測序。Toll樣受體4(TLR4)有3個SNP位點,位于5′調控區的AF177765(G2244A)和(A2299G)以及(C2242T,rs10116253)。按照SNaPshot試劑盒方法進行TLR4 SNP分型,多態性位點引物序列見表2。

表2TLR4基因單核苷酸多態性位點引物

Table2TheprimerofTLR4singlenucleotidepolymorphismgenelocus

基因位點 引物序列AF177765G2244AG/AF:TGTGTCAGGCACTGCTCTAAAATCR:GCAAGTGCAATGTAAGTTTCTGTTE-R:CTCCAAGCACTTCCAATCCAAAF177765A2299GG/AF:TGTGTCAGGCACTGCTCTAAAATCR:GCAAGTGCAATGTAAGTTTCTGTTE-F:GATATTACAGTAGAACTATCTAGGACT-TAGCrs10116253C2242TC/TF:TTAGTGTGCATAAGGCATGCTCR:CCCTTACTTCCTCATTTCTCATE-F:AACTAGCCCTGGTAAGTGCAGTC

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 TLR4 G2244A基因多態性與細胞因子及TLR4、MyD88的關系

TLR4 G2244A中GG,GA,AA三種基因型TNF-α、IL-6、IL-1β的表達差異無統計學意義(P>0.05);但是GG/GA與AA之間TNF-α、IL-6表達差異有統計學意義(P=0.036 7,P=0.031 7)。TLR4 G2244A中GG,GA,AA三種基因型TLR4和MyD88的表達無差異(P>0.05);但是GG/GA與AA型之間MyD88的表達差異有統計學意義(P=0.035 2),GG/GA的表達明顯高于AA(1.40±0.21vs1.58±0.25,見表3,4)。

表3TLR4G2244A位點三組基因型TLR4和MyD88mRNA及細胞因子水平的比較

Table3ComparisonoflevelsofTLR4,MyD88mRNAandcytokineamongthreegenotypeswithTLR4G2244A

基因型nTNF-α(pg/ml)IL-1β(pg/ml)IL-6(pg/ml)TLR4MyD88GG30903.68±354.48875.68±340.066219.6±4151.61.45±0.191.36±0.13GA18810.41±447.52971.09±447.796589.1±4442.81.57±0.311.47±0.29AA61189.80±358.96 1050.30±212.12 3086.1±1243.31.91±0.421.58±0.32P0.07570.45400.08600.14140.2519

TLR4和MyD88 mRNA表達量為Ct值

表4TLR4G2244A位點兩組基因型TLR4和MyD88mRNA及細胞因子水平的比較

Table4ComparisonoflevelsofTLR4,MyD88mRNAandcytokinebetweentwogenotypeswithTLR4G2244A

基因型nTNF-α(pg/ml) IL-1β(pg/ml) IL-6(pg/ml)TLR4MyD88 GG/GA48866.80±391.43910.94±381.346351.0±4210.61.50±0.251.40±0.21 AA61189.80±358.961050.30±212.123086.1±1243.31.91±0.421.58±0.32 P 0.0367 0.28920.03170.07680.0352

TLR4和MyD88 mRNA表達量為Ct值

2.2 TLR4 A2299G基因多態性與細胞因子及TLR2，4，MyD88的關系

TLR4 A2299G中AA,AG,GG三種基因型TNF-α、IL-6、IL-1β及TLR4、MyD88的表達均無差異(P>0.05);AA與GG/GA之間也無差異(P>0.05,見表5)。

2.3 TLR4 T2242C基因多態性與細胞因子及TLR2，4，MyD88的關系

TLR4 A2299G中三種基因型TT,CT,CC的TNF-α、IL-6、IL-1β、TLR2、TLR4及MyD88表達無差異(P>0.05);TT與CT/CC之間也無差異(P>0.05,見表6)。

表5TLR4(2299A→G)位點三組基因型TLR4和MyD88mRNA及細胞因子水平的比較

Table5ComparisonoflevelsofTLR4,MyD88mRNAandcytokineamongthreegenotypeswithTLR4(2299A→G)

基因型nTNF-α(pg/ml)IL-1β(pg/ml)IL-6(pg/ml)TLR4MyD88AA19821.66±305.45872.60±375.884784.8±2505.21.45±0.211.39±0.12GA21931.00±574.12935.53±439.215361.3±2873.41.53±0.311.42±0.29GG121073.60±556.80 980.22±444.866646.0±3698.71.64±0.331.46±0.21P0.570.86050.45300.35410.2304

TLR4和MyD88 mRNA表達量為Ct值

表6TLR4(2242T→C)位點三組基因型TLR4和MyD88mRNA及細胞因子水平的比較

Table6ComparisonoflevelsofTLR4,MyD88mRNAandcytokineamongthreegenotypeswithTLR4(2242T→C)

分組nTNF-α(pg/ml)IL-1β(pg/ml)IL-6(pg/ml)TLR4MyD88TT17 797.56±363.561080.3±364.204726.6±2623.31.46±0.201.42±0.24CT201056.50±587.04982.93±365.374976.8±3210.11.53±0.321.38±0.20CC121073.60±556.801050.80±408.21 5038.2±3600.41.67±0.321.46±0.21P0.29330.80890.99210.24760.2186

TLR4和MyD88 mRNA表達量為Ct值

3 討論

天然免疫受體TLR4識別配體之后主要通過銜接蛋白髓樣分化因子88(MyD88)依賴性途徑傳遞信號,繼而產生炎癥細胞因子如IL-1,IL-6,IL-8和TNF-α等的轉錄,激活天然免疫系統,殺傷入侵病原微生物。由于TLR在天然免疫中的重要作用,這類基因的多態性可改變感染的宿主易感性,國內外學者研究表明人TLR4基因(Asp299Gly和Thr399Ile)多態性可能與多種感染疾病易感性及發展和預后相關。Michel等[8]發現,Asp299Gly和Thr399Ile單核苷酸多態性與機體對LPS低反應性有關。研究表明TLR4基因多態性與軍團菌肺炎可能有關,TLR4基因的單核苷酸多態性由于改變了受體結構域,可影響對病原體的識別,減弱或抑制LPS信號轉導,從而導致機體對軍團菌的天然免疫反應減弱。TLR4編碼區的Asp299Gly(D299G)和Thr399 Ile(T399I)這兩個單核苷酸多態性與多種感染性疾病包括膿毒癥、肺炎球菌病、念珠菌感染等的易感性及發展和預后相關。但是TLR4 Asp299Gly和Thr399Ile基因多態性在亞洲人群中極為少見,呂欣等[9]檢測了健康漢族人群及缺血性卒中患者DNA樣本,未發現Asp299Gly和Thr399Ile基因多態性。Hang等[10]也認為TLR4基因編碼區Asp299Gly和Thr399Ile基因多態性在中國人群中非常罕見。馮凱等[6]發現在我國漢族人群TLR4基因多態性有2個位于5′調控區的新的高頻分布SNP(即TLR4(2244G→A)、TLR4 (2299A→G)；王永堂[7]發現TLR4基因啟動子區存在高頻SNP(2242T→C),堿基變異頻率為43.27%,2242 T→C堿基變異可增強TLR4基因啟動子活性,有可能為功能性突變。并且證明2242T→C堿基變異能顯著增強個體對內毒素的反應性,進一步通過人群實驗提示含TLR4基因5′啟動子區2242 C等位基因的個體在嚴重創傷后發展成MODS及膿毒癥的危險性相對較高,對膿毒癥可能是一個易感因子。

那么TLR4(2244G→A)、(2299A→G)、(2242T→C)基因單核苷酸多態性與軍團菌感染易感性的關系如何,TLR4基因多態性對信號轉導通路中MyD88表達水平、細胞因子水平的影響如何,國內外還未見研究報道。本研究通過體外實驗探討TLR4基因多態性與軍團菌宿主易感性的分子機制，分析了軍團菌刺激具有TLR4不同基因型的個體外周血PBMC后相應的信號通路分子MyD88及其相關細胞因子表達水平。結果發現，與TLR4(G2244A)AA基因型相比,GG/GA型個體的PBMC受到軍團菌刺激后表達較高水平的MyD88(P=0.035 2)和IL-6(P=0.031 7)以及較低水平的TNF-α(P=0.036 7),而IL-1β表達未見差別,故而TLR4 G2244A中AA與軍團菌感染易感性有待于增加樣本量做進一步的研究;然而TLR4 A2299G及TLR4 T2242C個體的PBMC在受到軍團菌刺激后MyD88 mRNA和TNF-α、IL-1β、IL-6的表達水平在各個基因型之間均無統計學差異(P>0.05)。表明TLR4(2299A→G)及TLR4(2242T→C)SNP與軍團菌感染易感性無關。

軍團菌病日益成為現代社會發展一個突出的公共衛生問題,軍團菌病易感性的研究是發病機制和病因學研究的關鍵問題之一,本課題通過體外實驗初步證實TLR4 G2244A、A2299G、T2242C基因多態性與軍團菌感染易感性無關。為探討TLR4基因多態性對人類軍團菌易感性的影響以及可能的機制提供線索,也為軍團菌病的發病機制及制定和采取有針對性的防治措施提供新的思路和科學依據。

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InvitroexperimentalofrelationshipbetweenToll-likereceptor4singlenucleotidepolymorphismandLegionellainfection

ZHANG Fan1*,QI Kun2,YAO Hong1

(1DepartmentofMicrobiologyandImmunology,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China；2DepartmentofGerontology,FirstHospitalofShanxiMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:zhangfan11688@126.com)

ObjectiveTo explore the association between Toll-like receptor 4 single nucleotide polymorphism(SNP) 2244G→A,2299A→G,2242T→C and the susceptibility of Legionella infection in vitro experimental research.MethodsThe peripheral blood mononuclear cells(PBMC) from healthy subjects(n=54) were stimulated with L. pneumophila. Real-time RT-PCR was used to detect the mRNA expression level of TLR4 and MyD88.The levels of TNF-α, IL-1b and IL-6 were measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). TLR4 genotyping was performed with SNaPshot technology.ResultsIn vitro assay results showed that the TNF-α expression was significantly higher in TLR4(G2244A) AA than in GG/GA(P=0.036 7). The mRNA expression of MyD88 and the level of IL-6 were significantly lower in TLR4(G2244A) AA than in GG/GA(P=0.035 2,0.031 7). Whereas the expression of TNF-α,IL-6,IL-1β,TLR4 and MyD88 showed no statistical difference among different genotypes of TLR4 A2299G and TLR4 T2242C polymorphism(P>0.05).ConclusionThe findings indicate that there is no association about the TLR4 (2244G→A),(2299A→G),(2242T→C) polymorphism with susceptibility to L. pneumophila infection.

gene polymorphism; Toll-like receptor; legionella; cytokine

R392.11

A

1007-6611(2017)10-1030-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.10.011

山西省自然科學基金資助項目(201601D102075)

張帆,女,1971-07生,博士,副教授,E-mail:zhangfan11688@126.com

2017-06-22