kshv-mir-k12-1-5p相關基因在卡波西肉瘤中的表達

張 靜,吳秀娟,普雄明*

(1新疆醫科大學附屬中醫醫院病理科,烏魯木齊 830000;2新疆維吾爾自治區人民醫院皮膚科;*通訊作者,E-mail:puxiongming@126.com)

kshv-mir-k12-1-5p相關基因在卡波西肉瘤中的表達

張 靜1,吳秀娟2,普雄明2*

(1新疆醫科大學附屬中醫醫院病理科,烏魯木齊 830000;2新疆維吾爾自治區人民醫院皮膚科;*通訊作者,E-mail:puxiongming@126.com)

目的 探索kshv-mir-k12-1-5p相關基因在卡波西肉瘤(KS)組織中的表達意義。 方法 通過在線miRNA靶基因軟件Mirbase、Miranda和Targetscan尋找kshv-mir-k12-1-5p的靶基因。通過GO和KEGG分析靶基因的信號通路及通路上的關鍵基因。使用免疫組化的方法檢測靶基因、關鍵基因(kshv-mir-k12-1-5p相關基因)在卡波西肉瘤組織的表達。 結果 kshv-mir-k12-1-5p的靶基因為CDKN1A,CDKN1A信號通路為Cell cycle通路,通路下游關鍵基因為CyclinD1、CyclinE。CDKN1A、CyclinD1、Cyclin E在腫瘤組織與瘤旁組織中的表達差異有統計學意義(P<0.05),CDKN1A在卡波西肉瘤中的陽性表達率低于瘤旁組織(P<0.05),CyclinD1、CyclinE在卡波西肉瘤中的陽性表達率高于瘤旁組織(P<0.05);在KS中CyclinD1與年齡相關(P<0.05),CyclinE與民族相關(P<0.05);在KS中CDKN1A與CyclinD1、CyclinE均呈負相關(P<0.05)。CyclinD1與CyclinE呈正相關(P<0.05)。 結論 kshv-mir-k12-1-5p的相關基因:CDKN1A、CyclinD1、CyclinE表達異常在KS發生、發展中具有重要的作用。

卡波西肉瘤; kshv-mir-k12-1-5p; CDKN1A; CyclinD1; CyclinE

卡波西肉瘤(Kaposis sarcoma, KS)是血管瘤樣結構、梭形細胞增生的惡性腫瘤[1],臨床有4種分型:經典型、非洲型、艾滋病病毒(AIDS)相關型及免疫抑制型。其中經典型及艾滋病病毒相關型在我國新疆地區報告較多,主要見于維吾爾族、哈薩克族等少數民族。卡波西肉瘤相關病毒(KSHV)是KS發生的必需因素和主要因素。KSHV通過編碼的miRNA調控宿主的生存環境、宿主細胞的細胞周期和沉默靶基因等諸多途徑影響感染細胞的分化狀態,進而影響宿主細胞的細胞周期,從而促進KSHV誘導KS發生。在既往的研究中,通過對KS miRNA差異表達譜的篩選和驗證得出在KS中kshv-mir-k12-1-5p表達明顯上調[2]。本文從病因上研究與kshv-mir-k12-1-5p相關基因在KS的表達,為研究kshv-mir-k12-1-5p對KS的調控作用做基礎。

1 材料與方法

1.1 病例來源

收集新疆醫科大學附屬中醫醫院及烏魯木齊市友誼醫院病理科卡波西肉瘤患者腫瘤和瘤旁組織40對石蠟組織,使用免疫組化方法對石蠟組織進行檢測。

1.2 主要試劑

試劑來源:購自福州邁新有限公司免疫組化一抗:CDKN1A(細胞周期素依賴蛋白激酶抑制劑1A)、CyclinD1(細胞周期蛋白D1)、CyclinE(細胞周期蛋白E)。

1.3 確定靶基因

通過在線miRNA靶基因軟件Mirbase,Miranda和Targetscan確定kshv-mir-k12-1-5p靶基因。Mirbase、Miranda、Targetscan網址如下:Mirbase: http://www.mirbase.org/,Miranda: http://www.microrna.org/microrna/home.do/,Targetscan: http://www.targetscan.org/vert-60/。

1.4 分析信號通路及關鍵基因

通過 GO 和 KEGG 分析靶基因的通路及通路上的關鍵基因。GO:http://www.geneontology.org,KEGG:http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html。

1.5 免疫組化檢測

使用免疫組化方法檢測石蠟組織中kshv-mir-k12-1-5p的相關基因:靶基因(CDKN1A)、信號通路關鍵基因(CyclinD1、CyclinE)的表達情況并分析其與臨床參數的關系。

1.6 結果判斷

每張切片隨機選取10個高倍視野(40×10倍),每個視野500-1 000 個細胞。從以下兩方面對切片進行計分: ① 染色強度: 0 分為無著色,1 分為淡黃色,2 分為棕黃色,3 分為棕褐色; ② 陽性細胞數: 1 分為1%-10%,2 分為 11%-50%,3 分為 51%-75%,4 分為≥76%。將兩項評分相乘得出最終結果，陰性(-): < 3 分,陽性(+):≥3 分。CDKN1A、CyclinD1為腫瘤梭形細胞核陽性著色。CyclinE為腫瘤梭形細胞核/細胞漿陽性著色。高年資病理醫師進行結果判定。

1.7 統計學分析

應用SPSS20.0統計軟件對數據進行統計學分析,計數資料的差異性及相關性采用卡方檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 kshv-mir-k12-1-5p的靶基因

通過靶基因軟件確定CDKN1A基因為kshv-mir-k12-1-5p的靶基因。

2.2 kshv-mir-k12-1-5p的信號通路及通路上關鍵基因

通過GO和KEGG分析得出kshv-mir-k12-1-5p及靶基因CDKN1A參與Cell cycle信號通路,CyclinD1、CyclinE為通路下游的關鍵基因。

2.3 CDKN1A、CyclinD1、CyclinE在卡波西肉瘤與瘤旁組織中的表達

卡波西肉瘤與瘤旁組織中CDKN1A、CyclinD1、CyclinE的表達情況見圖1。CDKN1A在卡波西肉瘤的陽性表達率(30.0%)明顯低于瘤旁組織中的陽性表達率(75.0%),差異具有統計學意義(P<0.05);CyclinD1在卡波西肉瘤的陽性表達率(80.0%)明顯高于瘤旁組織中的陽性表達率(40.0%),差異具有統計學意義(P<0.05);CyclinE在卡波西肉瘤的陽性表達率明顯高于瘤旁組織中的陽性表達率,差異具有統計學意義(82.5%vs37.5%，P<0.05，見表1)。

表1CDKN1A、CyclinD1、CyclinE在卡波西肉瘤及瘤旁組織中的表達

Table1ExpressionofCDKN1A，CyclinD1，CyclinEinKSandadjacenttissue

類型nCDKN1ACyclinD1CyclinE+χ2P+χ2P+χ2P腫瘤4012(30.0)16.240.0032(80.0)13.330.0033(82.5)16.880.00瘤旁4030(75.0)16(40.0)15(37.5)

2.4 CDKN1A、CyclinD1、CyclinE與卡波西肉瘤臨床參數的關系分析

分析CDKN1A、CyclinD1、CyclinE與患者性別、發病年齡、民族、臨床類型的關系。CyclinD1與年齡有關(P<0.05),CyclinE與民族有關(P<0.05,見表2)。

A. CyclinD1在腫瘤細胞核陽性表達;B. CDKN1A在腫瘤細胞核陽性表達;C. CyclinE在腫瘤細胞核陽性表達; D. CyclinD1在瘤旁組織陰性表達;E. CDKN1A在瘤旁組織細胞核陽性表達;F. CyclinE在瘤旁組織陰性表達圖1 CDKN1A、CyclinD1、CyclinE在卡波西肉瘤中免疫組化染色 (40×10)Figure 1 Expression of CDKN1A,CyclinD1,CyclinE in KS by immunohistochemistry (40×10)

表2CDKN1A、CyclinD1、CyclinE同卡波西肉瘤臨床參數的關系

Table2TherelationshipsofCDKN1A,CyclinD1,CyclinEwiththeclinicalfeaturesofKS

因素nCDKN1ACyclinD1CyclinE+-χ2P+-χ2P+-χ2P 性別1.090.300.001.000.620.43 男35926287305 女5324132 年齡0.050.835.010.030.020.965 >4526719242224 ≤45145986113 民族0.001.000.360.554.180.04 維族351025296314 其他5233223 臨床類型0.001.001.230.271.230.27 CKS4133122 AIDS-KS361125297315

2.5 CDKN1A、CyclinD1、CyclinE在卡波西肉瘤中的相關性分析

在KS中CDKN1A與CyclinD1、CyclinE均呈負相關(P<0.05,見表3)。CyclinD1與CyclinE呈正相關(P<0.05,見表4)。

表3卡波西肉瘤中CDKN1A與CyclinD1、CyclinE的相關性

Table3ThecorrelationwithCDKN1AandCyclinD1,CyclinEinKS

CDKN1ACyclinD1CyclinE+-χ2P+-χ2P陽性667.150.007754.750.029陰性262262

表4卡波西肉瘤中CyclinD1與CyclinE的相關性

Table4ThecorrelationwithCyclinD1andCyclinEinKS

CyclinECyclinD1+-χ2P陽性2934.770.029陰性44

3 討論

卡波西肉瘤相關病毒(KSHV,即人皰疹病毒8型)[2]首先從AIDS相關型KS患者的肉瘤組織中發現。隨后,在各型的KS中均發現了KSHV的高表達。KSHV與KS的發生關系密切。KSHV致瘤過程主要發生在病毒感染的潛伏期[3]。

本文通過在線miRNA靶基因軟件確定kshv-mir-k12-1-5p的靶基因CDKN1A。通過GO和KEGG分析kshv-mir-k12-1-5p和靶基因的信號通路為Cell cycle信號通路及通路下游的關鍵基因CyclinD1、CyclinE。因此，CDKN1A、CyclinD1、CyclinE為kshv-mir-k12-1-5p的相關基因,共同參與細胞周期的調控。

細胞周期異常調控導致細胞異常增殖,是腫瘤發生的基礎。細胞周期(cell cycle)信號通路中的關鍵基因CDKN1A、CyclinD1、CyclinE的異常表達和卡波西肉瘤的發生密不可分。CyclinE和CyclinDl是細胞周期G1/S轉換的正性重要調控因子。表達上調使G1/S轉換時間變短,促進了細胞周期進程,細胞增殖過度,最終細胞癌變。本實驗中CyclinD1、CyclinE在KS中高表達。卡波西肉瘤組明顯高于對照組。CDKN1的生物學功能是抑制細胞生長、DNA復制;調控發育、分化等過程,與腫瘤的發生發展密切相關。本實驗中CDKN1A陽性表達率在卡波西肉瘤組明顯低于對照組。因為CDKN1A是一種罕見突變的抑癌基因,它在KS發展過程中,逐漸失去對細胞增殖的抑制作用,其蛋白水平降低參與KS的發生發展。本實驗在KS中CyclinD1與年齡相關(P<0.05);CyclinE與民族相關(P<0.05);CDKN1A與CyclinD1、CyclinE均呈負相關;CyclinD1與CyclinE呈正相關。正常情況下CDKN1A的表達對停滯增長起重要作用。CDKN1A表達上調可抑制CDK的活性,抑制CyclinD1-CDK4/6復合物及CyclinE-CDK2復合物活性,使蛋白表達下調;表達受抑。細胞不能進入S期,導致細胞周期停滯。研究證實CyclinD1、CyclinE在多種腫瘤中出現過度表達[10]。兩者具有協同作用,和本實驗結論相似。因為在腫瘤的進展中,CDKN1A表達下調,對CyclinD1、CyclinE的抑制減弱,導致CyclinD1、CyclinE表達失控。

本研究為kshv-mir-k12-1-5p通過信號通路調控靶基因及關鍵基因的研究做基礎,接下來將構建kshv-mir-k12-1-5pmimic、kshv-mir-k12-1-5p inhibitor等,轉染到卡波西肉瘤細胞株中,研究過表達或低表達kshv-mir-k12-1-5p后,采用qRT-PCR及WB檢測信號通路靶基因、關鍵基因(CDKN1A、CyclinD1、CyclinE)的mRNA和蛋白表達情況,明確kshv-mir-k12-1-5p對信號通路主要的調控作用，確定kshv-mir-k12-1-5p能否作為一個藥物靶標。因此，先行檢測在未調控下CDKN1A、CyclinD1、CyclinE在KS中的表達,了解其表達的意義。

[1] 阮光靖. 艾滋病相關卡波西肉瘤的臨床表現和治療以及療效分析[J]. 當代醫學, 2016, 22(27): 49-50.

[2] 吳秀娟. 卡波西肉瘤miRNA差異表達譜的篩選及miR-126-3p對卡波西肉瘤細胞株SLK生物學性狀的影響及靶基因研究[D].合肥:安徽醫科大學,2015.

[3] Ballon G, Akar G, Cesarman E. Systemic expression of Kaposi sarcoma herpesvirus (KSHV) Vflip in endothelial cells leads to a profound proinflammatory phenotype and myeloid lineage remodeling in vivo[J]. PLoS Pathogens, 2015, 11(1): e1004581.

[4] 高媛, 譚曉華, 楊磊. 卡波濟肉瘤相關皰疹病毒編碼的microRNAs最新研究進展[J]. 中國病毒病雜志, 2013, 3(1):71-74.

[5] 趙洋, 張魁, 董然. miR-17對靶基因轉化生長因子受體β-2的負性調控表達[J]. 中華實用診斷與治療雜志, 2015, 29(2):129-131.

[6] 張和細，壟輝.miRNA與動脈粥樣硬化研究進展[J].中華實用診斷與治療雜志,2015,28(1):1-3.

[7] Grundhoff A, Sullivan CS. Virus-encoded microRNAs[J]. Virology, 2011, 411(2): 325-343.

[8] 吳秀娟, 普雄明. MicroRNAs在卡波西肉瘤發病機制中的研究進展[J]. 國際病毒學雜志, 2013, 20(6): 281-284.

[9] Wu XJ, Pu XM, Zhao ZF,etal. The expression profiles of microRNAs in Kaposi’s sarcoma [J]. Tumor Biol, 2015, 36(1):437-446.

[10] 劉馨蓮, 李淑蓉, 孫靜. 細胞周期蛋白在食管癌中的表達及意義[J]. 中國實驗診斷學, 2012, 7(16):1249-1252.

Expressionofkshv-mir-k12-1-5p-relatedgeneinKaposi’ssarcoma

ZHANG Jing1，WU Xiujuan2，PU Xiongming2*

(1DepartmentofPathology,AffiliatedTraditionalChineseMedicineHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830000,China;2DepartmentofDermatology,People’sHospitalofXinjiangUygurAutonomousRegion;*Correspondingauthor,E-mail:puxiongming@126.com)

ObjectiveTo explore the expression of kshv-mir-k12-1-5p-related gene in Kaposi’s sarcoma (KS) and its significance.MethodsThe kshv-mir-k12-1-5p target gene was detected through Mirbase, Miranda and Targetscan of the online miRNA target gene software. GO and KEGG were used to analyze signaling pathway and key gene in the pathway of the target gene. The expression of target gene and key gene(kshv-mir-k12-1-5p-related gene) was detected in Kaposi’s sarcoma by immunohistochemistry.ResultsThe target gene of kshv-mir-k12-1-5p was CDKN1A, CDKN1A signaling pathway was the cell cycle pathway, and the downstream key genes were CyclinD1 and CyclinE. Positive expression rate of CDKN1A in KS was lower in tumor tissues than that of adjacent tissues(P<0.05). Positive expression rates of CyclinD1,CyclinE in KS were higher in tumor tissues than that of adjacent tissues(P<0.05).Expression of CyclinD1 in KS was associated with age(P<0.05). Expression of CyclinE in KS was associated with nation(P<0.05). There was a negative correlation between the expression of CDKN1A and CyclinD1,CyclinE in KS(P<0.05).There was a positive correlation between the expression of CyclinD1 and CyclinE in KS(P<0.05).ConclusionThe expression of kshv-mir-k12-1-5p-related genes CDKN1A, CyclinD1, and CyclinE may play an important role in the occurrence and development of KS.

Kaposis sarcoma； kshv-mir-k12-1-5p; CDKN1A; CyclinD1; CyclinE

R739.5

A

1007-6611(2017)10-1044-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.10.014

國家自然科學基金資助項目(81660454);新疆醫科大學附屬中醫醫院院級課題(ZYY201702)

張靜,女,1979-12生,在讀博士,主治醫師

2017-07-10