miR-152在聲門上型喉癌中的表達及臨床病理關系

遲 慧，宋 巖，那 迪，白偉良

miR-152在聲門上型喉癌中的表達及臨床病理關系

遲 慧1，宋 巖1，那 迪2，白偉良1

目的探討并分析miR-152在聲門上型喉癌組織中的表達情況，為進一步研究miR-152用于治療靶向藥物、評估預后提供參考依據。方法采用Real-time PCR法檢測83例患有聲門上型喉癌患者癌組織中miR-152的表達，并將miR-152的表達數據與臨床病理數據進行對比分析。最后，通過MTT方法對比轉染了miR-152模擬物組和陰性對照組的Hep-2細胞系受抑制情況。結果miR-152在聲門上型喉癌組織中顯著低表達(t=12.65，P<0.001)，并且其低表達與聲門上型喉癌的T分期(χ2=26.88，P<0.001)和N分期(Z=-3.56，P<0.001)相關。miR-152可抑制Hep-2細胞增殖。結論miR-152可能作為聲門上型喉癌預后的新靶點。

聲門上型喉癌；MiR-152；Hep-2細胞系；臨床相關性

0 引言

頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)是全球第6大常見癌癥。每年有160萬新發病例，33.3萬死于鱗狀細胞癌，其中有一半發生在口腔(口腔鱗狀細胞癌)[1]。每年全世界有500 000名患者被診斷為頭頸鱗狀細胞癌。在發達國家中有95%的喉癌為鱗狀細胞癌，占惡性腫瘤的5%，嚴重威脅著人類的健康。喉癌的發生和發展涉及許多基因和信號通路。喉癌的發病機制始終沒有被闡釋清楚。

miRNAs是大小約為19～23 nt的非編碼RNA，在進化過程中高度保守，能夠與靶基因結合，在轉錄后水平調節基因的表達水平。其被RNA多聚酶Ⅱ轉錄為pri-miRNA，再被RNA酶ⅢDrosha加工為70～100個核苷酸的pre-miRNA[2]。越來越多的證據表明，miRNA的調控失調與多種疾病相關。目前，研究表明，miRNA在腫瘤的發展中起重要的作用。然而，miRNA在喉癌中的調控機制仍然是未知的。

最近的研究顯示，一些miRNA與喉癌相關。Su等[3]發現，在非小細胞肺癌中miR-152的恢復顯著抑制了增殖、克隆形成、轉移和侵襲[4]。Huang等[5]認為，miR-152可能抑制肝癌的增殖。Zhu等[6]認為，miR-152可以抑制PCa細胞的遷移和侵襲。Zheng等[7]發現，在體內侵襲實驗中，miR-15b和miR-152可以顯著降低9L細胞的侵襲能力。Woo等[8]在體外實驗中發現，miR-128 和miR-152在卵巢癌中下調了CSF-1 mRNA和蛋白的表達，導致細胞運動性和黏附性降低。

本研究探討并分析miR-152在聲門上型喉癌組織中的表達情況，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 資料 本研究經中國醫科大學倫理委員會批準。所有83例樣本均來自我院2008年5月至2013年8月確診為聲門上型喉癌的患者。所有患者均未發生遠端轉移，術前沒有接受過放療和化療，接受喉全切除術。對照組黏膜樣本取自同一患者腫瘤組織邊緣2 cm處。術后新鮮標本立刻進行液氮冷凍，于-80 ℃保存。相關資料(年齡、性別、腫瘤T分期、N分期、患者腫瘤不同分級)均來自我院患者資料信息庫。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和miRNA mimics轉染 人喉癌細胞系Hep-2購自武漢大學保藏中心細胞庫。采用RPMI 1640培養基(Gibco)，添加10%血清(Hyclone)，100 U/mL青鏈雙抗(Life Technologies)，5% CO2、37 ℃下培養。所有實驗均采用對數生長期細胞。在Opti MEM (Invitrogen)培養基中使用lipo2000介導Hep-2細胞進行miR-152 mimic和miRNA mimics 陰性對照(Invitrogen，CA，USA)的轉染。

1.2.2 Real-time PCR 采用Rotor-gene 6000系統(QIAGEN，Valencia，CA)，Universal qPCR通用試劑盒。25 μL PCR體系中包含2 μL反轉錄產物，12.5 μL SYBR Green supermix，8.5 μL 無酶水，1 μL正向引物和1 μL反向引物。本反應在36孔板上進行，反應條件為94 ℃ 5 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共計45個循環。使用U6RNA作為內參去標準化miR-152的表達。閾值周期數據采用默認。對比癌組織和癌旁組織中miRNA的表達水平，并采用2-ΔΔCt的方法進行計算[9]。miR-152的相對表達率已經根據內參基因進行了歸一化處理，并于癌旁組織做對比。引物序列見表1。

1.2.3 MTT法檢測細胞活力 采用MTT法檢測細胞增殖的活力。轉染24 h后，將轉有miR-152 mimics的Hep-2細胞和轉有NC的Hep-2細胞鋪96孔板，分別孵育24、48、96 h。之后，加入20 μL MTT (5 mg/mL) 37 ℃孵育4 h，室溫下加入150 μL DMSO以溶解結晶。使用MK3型酶標儀(Thermo，Waltham，MA，USA)測490 nm下的吸光度值。所有實驗重復3次，并與生長抑制率做對比。

1.3 統計學分析 采用公式2-ΔΔCt計算癌和癌旁組織中的相對表達量(ΔCt=CtmiR-152-CtU6；ΔΔCt=ΔCtcancer-ΔCtcontrol)。生長抑制率采用如下公式計算：(AC-AT)/AC×100% (AC=對照組吸收值，AT=實驗組吸收值)[10]。

2 結果

2.1 喉癌中miR-152的表達 對比分析83例進行喉全切除術患者的成對樣本中miR-152的表達。對比分析癌組織和黏膜組織的ΔCt值。癌組織中ΔCt值為1.92±1.25，對照組為-0.19±1.62。其中74例(89%)與對照組相比為miR-152低表達(t=12.65，P<0.001)。見圖1。

2.2 miR-152的表達與臨床病理因素的關系 采用非參數測定法分析miR-152和臨床病理參數之間的關系(包括性別、年齡、T分期、N分期和細胞分化程度)。miR-152的水平在性別、年齡和腫瘤位置之間沒有顯著差異。miR-152低表達趨向于促進了聲門上型喉癌的T分期和N分期(χ2=26.88，P<0.001；Z=-3.56，P<0.001)。具體見表2。

表1 用于RT-PCR擴增的miR-152的引物序列

圖1 聲門上型喉癌患者miR-152表達情況

表2 miR-152的表達量與聲門上型喉癌患者臨床病理因素的關系

2.3 miR-152對Hep-2細胞增殖的影響 為了評價轉染miR-152前后Hep-2細胞的細胞活性，我們對比了轉染miR-152模擬物的Hep-2細胞和轉染miR-152陰性對照模擬物Hep-2細胞的生長情況。24、48、96 h后，轉染模擬物組的抑制率為25%、27%、42.7%，轉染陰性對照組的抑制率為8.3%、6.0%、7.3%。如圖2所示，轉染模擬物組的抑制率顯著提高。

圖2 MTT檢測轉染miR-152后Hep-2細胞生長抑制率

3 討論

MicroRNA是一群小的高度保守非編碼單鏈RNA家族，通過轉錄抑制或結合到轉錄體的3′-UTR區靶點，降解mRNA，發揮調控基因表達的作用，在腫瘤發生、發展過程中發揮重要作用。miRNA在病理生理過程中具有關鍵的作用，調控許多生理進程，包括細胞增殖、分化、凋亡、轉移和致瘤性轉化[11]。成熟miR-152序列為54︱5′-UCAGUGCAUGACAGAACUUGGG-3′︱75，許多腫瘤和正常組織都表達miR-152，但其在發生、發展和腫瘤形成等不同時期呈現差異表達。miR-152在消化道系統[12-13]和生殖系統腫瘤[14]細胞和組織中表達下降，并對腫瘤細胞生長、增殖、血管新生等發揮重要的生物學功能，起抑癌基因作用，并在一定程度上與疾病的分期、預后相關。Azizi等[15]通過對比1型糖尿病患者和年齡相對應的正常人發現，有12個上調的miRNA，其中包括miR-152。

miR-152在許多組織中表達降低，提示其可以作為腫瘤抑制miRNA。Huang等[16]研究顯示，與附近的非癌性肝組織相比，miR-152在HBV相關的HCC組織中的表達下降。有報道，在胃腸道癌中，miR-148a和miR-152在癌組織和癌細胞系表達下調，且miR-152的低表達與增加的腫瘤大小和T分期的進展相關[17-18]。本研究中，miR-152低表達與聲門上喉癌的T分期和N分期相關，提示miR-152可能成為潛在的生物標記物。

MTT試驗結果顯示，miR-152模擬物轉染后的Hep-2細胞增殖呈時間依賴性降低，提示 miR-152能夠抑制Hep-2細胞增長。在83例患者中，74例患者腫瘤組織中miR-152表達降低。在聲門上型喉癌中miR-152 表達顯著降低 (t=12.65，P<0.001)。

聲門上型喉癌中miR-152表達結果顯示，miR-152低表達與較差的T分期和N分期有顯著的關聯。T3、T4期聲門上型喉癌組織中miR-152表達較T2期明顯降低(χ2=26.88，P<0.001)。本研究首次發現，miR-152的低表達與N分期相關(Z=-3.56，P<0.001)。本研究沒有包括T1期的聲門上型喉癌，所有T1期的聲門上型喉癌均采用激光治療。

本文中，83例患者均被診斷為聲門上型喉癌。根據病變的部位，喉癌分為聲門上、聲門、聲門下3種類型。因為在聲門區域缺少淋巴，喉癌不傾向于淋巴結轉移。為了使結果客觀準確，我們選擇的所有病例均經病理確診為聲門上型喉癌。

在聲門上型喉癌中miR-152的表達與細胞分化沒有顯著關系。通過樣本偏差來解釋所得到的結果，有60例被診斷為高度分化(60/83)，低分化的病例所占比例很小。因此，結果或許有偏差，期望以后通過擴大樣本量來解決此問題。

本文按照N分期將所有病例分為2組。組1包括所有處于N0期的病例；組2包括所有N1、N2、N3、N4期的病例?？紤]到樣本量較小，我們沒有將N1～N4繼續細分。盡管所有病例僅被分成2組，依然可以顯示miR-152和淋巴結轉移之間的相關性。

T分期和N分期較差是生存率的獨立預后因素，表明miR-152表達在診斷方面可能作為生物學標志物；在治療方面，可能會成為一種藥物用于靶向治療；在預后評估方面，可能為臨床評價及判斷預后提供參考依據。

[1] Jemal A,Siegel R,Ward E,et al.Cancer statistics,2009[J].CA Cancer J Clin,2009,59(4):225-249.

[2] Bartel DP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116:281-297.

[3] Su Y,Wang Y,Zhou H,et al.MicroRNA-152 targets ADAM17 to suppress NSCLC progression[J].FEBS Lett,2014,588(10):1983-1988.

[4] Azizi M,Teimoori-Toolabi L,Arzanani MK,et al.MicroRNA-148b and microRNA-152 reactivate tumor suppressor genes through suppression of DNA methyltransferase-1 gene in pancreatic cancer cell lines[J].Cancer Biol Ther,2014,15(4):419-427.

[5] Huang S,Xie Y,Yang P,et al.HCV core protein-induced down-regulation of microRNA-152 promoted aberrant proliferation by regulating Wnt1 in HepG2 cells[J].PLoS One,2014,9(1):e81730.

[6] Zhu C,Li J,Ding Q,et al.miR-152 controls migration and invasive potential by targeting TGFα in prostate cancer cell lines[J].Prostate,2013,73(10):1082-1089.

[7] Zheng X,Chopp M,Lu Y,et al.MiR-15b and miR-152 reduce glioma cell invasion and angiogenesis via NRP-2 and MMP-3[J].Cancer Lett,2013,329(2):146-154.

[8] Woo HH,László CF,Greco S,et al.Regulation of colony stimulating factor-1 expression and ovarian cancer cell behavior in vitro by miR-128 and miR-152[J].Mol Cancer,2012,11:58.

[9] Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method[J].methods,2001,25(4):402-408.

[10]Luan S,Sun L,Huang F.MicroRNA-34a:a novel tumor suppressor in p53-mutant glioma cell line U251[J].Arch Med Res,2010,41(2):67-74.

[11]Huang Y,Shen XJ,Zou Q,et al.Biological functions of microRNAs:a review[J].J Physiol Biochem,2011,67(1):129-139.

[12]王春明,左君波,居峰,等.MicroRNA-152在胃癌細胞中表達及對細胞增殖的影響[J].海南醫學,2013,24(7):943-946.

[13]汪毅,袁偉,馬肖,等.miR-152在結直腸癌組織中的表達及其與預后的關系[J].中華腫瘤雜志,2016,38(10):763-766.

[14]趙立紅,石淑莉,齊秀玲.miR-218和miR-152在漿液性卵巢癌的表達及臨床意義[J].生殖醫學雜志,2015,24(4):293-296.

[15]Azizi M,Teimoori-Toolabi L,Arzanani MK,et al.MicroRNA-148b and microRNA-152 reactivate tumor suppressor genes through suppression of DNA methyltransferase-1 gene in pancreatic cancer cell lines[J].Cancer Biol Ther,2014,15(4):419-427.

[16]Huang S,Xie Y,Yang P,et al.HCV core protein-induced down-regulation of microRNA-152 promoted aberrant proliferation by regulating Wnt1 in HepG2 cells[J].PLoS One,2014,9(1):e81730.

[17]K?hler CU,Bryk O,Meier S,et al.Analyses in human urothelial cells identify methylation of miR-152,miR-200b and miR-10a genes as candidate bladder cancer biomarkers[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,438(1):48-53.

[18]Su Y,Wang Y,Zhou H,et al.MicroRNA-152 targets ADAM17 to suppress NSCLC progression[J].FEBS Lett,2014,588(10):1983-1988.

ExpressionofmiR-152anditsclinicalpathologicalsignificanceinsupragalotticlaryngealcarcinoma

CHI Hui1,SONG Yan1,NA Di2,BAI Wei-liang1

(1.Department of Otorhinolaryngology,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China;2.the First Hospital of China Medical University,Shenyang 110001,China)

ObjectiveTo discuss and analyze the expression of miR-152 in tissues of patients with supragalottic laryngeal carcinoma,and provide reference data for further study of the function of miR-152 in tumor target medicine and prediction of the prognosis of supragalottic laryngeal carcinoma.MethodsThe expression of miR-152 was detected in tissues of 83 patients with supragalottic laryngeal carcinoma by Real-time PCR,and the relationship between the expression of miR-152 and clinicopathological parameters was analyzed.The inhibition of the Hep-2 cells which was transfected with miR-152 mimics and transfected with mimics negative control by MTT was compared.ResultsmiR-152 was significantly low-expressed in supragalottic laryngeal carcinoma (t=12.65,P<0.001).Moreover,low-expression of miR-152 was correlated with stage pT (χ2=26.88,P<0.001) and stage pN (Z=-3.56,P<0.001) in supragalottic laryngeal carcinoma.MiR-152 could inhibit the cell proliferation in Hep-2 cells.ConclusionMiR-152 may act as a new tumor target to predict the prognosis of supragalottic laryngeal carcinoma.

Supragalottic laryngeal carcinoma;miR-152;Hep-2 cell line;Clinical relevance

2017-01-28

1.中國醫科大學附屬盛京醫院，沈陽 110004;2.中國醫科大學附屬第一醫院，沈陽 110001

遼寧省教育廳科學研究一般項目(L2015586)；沈陽市科學計劃項目資助(F13-220-9-21)；遼寧省科學事業公益研究基金(2013001010)；遼寧省自然科學基金(20170541043)

10.14053/j.cnki.ppcr.201710008