注射用雷替曲塞對胃癌患者癌細(xì)胞的影響及作用機制研究

馬世華， 施能勝

(1.江蘇省南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院藥劑科， 江蘇 南京 211200 2. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬江寧醫(yī)院藥學(xué)部， 江蘇 南京 211100)

注射用雷替曲塞對胃癌患者癌細(xì)胞的影響及作用機制研究

馬世華1， 施能勝1

(1.江蘇省南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院藥劑科， 江蘇 南京2112002. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬江寧醫(yī)院藥學(xué)部， 江蘇 南京211100)

目的了解注射液雷替曲塞對胃癌患者癌細(xì)胞的影響及作用機制。方法將購入的84只裸鼠建立人胃癌細(xì)胞MGC-803皮下移植瘤模型，建模成功后隨機分為3組，常規(guī)組給予腹腔注射生理鹽水，雷替曲塞組給予腹腔注射雷替曲塞，5-Fu組給予腹腔注射5-Fu，詳細(xì)觀察對比干預(yù)后裸鼠體重、移植瘤體積、瘤重、抑瘤率、凋亡率及癌細(xì)胞的周期分布情況。結(jié)果常規(guī)組裸鼠體重、移植瘤體積、瘤重均高于雷替曲塞組與5-Fu組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；雷替曲塞組裸鼠體重高于5-Fu組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，雷替曲塞組移植瘤體積、瘤重低于5-Fu組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；常規(guī)組裸鼠癌細(xì)胞S期分布高于雷替曲塞組與5-Fu組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；雷替曲塞組與5-Fu組S期分布，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；雷替曲塞組與5-Fu組G0/G1，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；雷替曲塞組與5-Fu組G0/G1期分布低于常規(guī)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；三組G2/M期分布無明顯差異，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；常規(guī)組癌細(xì)胞抑瘤率、凋亡率明顯低于雷替曲塞組與5-Fu組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；雷替曲塞組癌細(xì)胞抑瘤率、凋亡率顯著高于5-Fu組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論胃癌患者給予雷替曲塞治療與5-Fu抑瘤效果相似，可有效抑制人胃癌細(xì)胞MGC-803裸鼠移植瘤生長，并可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。

雷替曲塞； 胃 癌； 5-Fu

胃癌是我國惡性腫瘤中發(fā)生率最高的，系源于上皮的惡性腫瘤，好發(fā)于中老年人群，且存在較高的死亡率，嚴(yán)重威脅患者身體健康[1,2]。氟尿嘧啶類藥物是胃癌化療的基本用藥，針對晚期胃癌患者化療是延長其存活時間、提高生活質(zhì)量的重要手段[3,4]。5-氟尿嘧啶(fluorouracil,5-FU)為嘧啶類抗代謝藥，可阻止脫氧尿嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶核苷酸，干擾DNA的合成，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡，但臨床用藥后大多數(shù)患者存在嚴(yán)重毒副作用及耐藥性[5,6]。本文通過建立人胃癌細(xì)胞MGC-803裸鼠皮下移植瘤模型，分別給予雷替曲塞、5-Fu、生理鹽水藥物干預(yù)，研究其作用機制，現(xiàn)將研究報道如下：

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物與細(xì)胞株實驗前一周從上海加科生物科技有限公司購入84只BALB/c雄性裸鼠(實驗動物質(zhì)量合格證編號：0000013647)，鼠齡均為4周，體重在16～20g。確定無特定病原體級屏障系統(tǒng)分籠飼養(yǎng)進(jìn)行實驗。人胃癌細(xì)胞株MGC-803由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院提供。本研究經(jīng)臨床醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并符合國家實驗動物“保護(hù)規(guī)范”及實驗動物管理條例。

1.1.2主要藥品與試劑鼠抗人p53單克隆抗體(購自上海常斤生物科技有限公司)，兔抗人GAPDH多克隆抗體(購自北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司)。注射用雷替曲塞(南京正大天晴制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字：H20090325)。5-Fu(5-氟尿嘧啶，購自西安海欣制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：H20050511)。

1.2實驗方法

1.2.1建立人胃癌細(xì)胞MGC-803裸鼠皮下移植瘤模型將人胃癌細(xì)胞MGC-803對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白自酶消化1min，制成1×107/mL濃度的單細(xì)胞懸液，在超凈臺內(nèi)于裸鼠腋下皮下注射0.2mL單細(xì)胞懸液(含活細(xì)胞數(shù)2×106個)。術(shù)后裸鼠全部存活，無明顯不適反應(yīng)。1周后裸鼠出現(xiàn)直徑>5mm的皮下結(jié)節(jié)。

1.2.2裸鼠分組及藥物干預(yù)建模完成后，將裸鼠隨機分為3組，各組裸鼠均采用剪耳法標(biāo)記，每組28只。在癌細(xì)胞接種后第10天，給予常規(guī)組裸鼠腹腔注射生理鹽水，給予雷替曲塞組裸鼠腹腔注射雷替曲塞(7.5mg/kg/d)，給予5-Fu組裸鼠腹腔注射5-Fu(12mg/kg/d)，3組患者每只腹腔注射量均為0.2mL，持續(xù)注射5d，停2d，再繼續(xù)給藥5d。用藥結(jié)束后2d，給予裸鼠頸椎脫位方式處死，將腫瘤組織連同包膜完整剝出，詳細(xì)觀察瘤體大體形態(tài)，取部分用于流式細(xì)胞分析的瘤體浸泡于70%酒精溶液，部分用于RT-PCR及Westernblot檢測的瘤體保存在零下80度的低溫冰箱中。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1裸鼠觀察對裸鼠的神經(jīng)狀態(tài)、飲食、大便等情況進(jìn)行嚴(yán)密觀察，并定期給裸鼠進(jìn)行稱重。

1.3.2人胃癌細(xì)胞MGC-803裸鼠皮下移植瘤生長觀察用游標(biāo)卡尺每隔3d對腫瘤長徑(A)與垂直橫徑(B)進(jìn)行測量，并按照公式V=AxB-/2計算腫瘤體積，并繪制腫瘤體積增長曲線。當(dāng)取出腫瘤組織后，稱取腫瘤組織質(zhì)量，并計算抑瘤率，計算公式為(對照組瘤重一實驗組瘤重)/對照組瘤重x100%=抑瘤率。

1.3.3裸鼠瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期分布與凋亡觀察將固定好的腫瘤組織剪碎、捻搓直至腫瘤組織搓完為止，過濾并去除混濁液的雜質(zhì)，離心沉淀后棄掉上清。用70%乙醇固定細(xì)胞，并采用Rnase酶消化，加入1mL溴化丙啶(PI)后放置4℃的冰箱中避光染色30min，并過濾，制成單細(xì)胞懸液供上機檢測。采用Muticy-c1eAV分析軟件對DNA周期進(jìn)行擬合分析，并計算出細(xì)胞周期分布的百分率及凋亡百分率。

2 結(jié) 果

2.1干預(yù)后裸鼠體重、移植瘤的體積、瘤重對比由表1、圖1可見，常規(guī)組裸鼠體重、移植瘤體積、瘤重均高于雷替曲塞組與5-Fu組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=18.65,385.01,490.73，P<0.05)；而雷替曲塞組裸鼠體重高于5-Fu組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.200,P>0.05)，移植瘤體積、瘤重等情況雷替曲塞組低于5-Fu組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.413,7.382,P<0.05)。

表1 干預(yù)后裸鼠體重及移植瘤的體積、重量比較

圖1 各組胃癌細(xì)胞裸鼠移植體積變化曲線

2.2胃癌MGC-803裸鼠移植瘤細(xì)胞在各組細(xì)胞周期分布的情況由表2可見，常規(guī)組裸鼠癌細(xì)胞S期分布高于雷替曲塞組與5-Fu組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=70.89，P<0.05)，而5-Fu與雷替曲塞組S期分布情況，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.958，P>0.05)；雷替曲塞組與5-Fu組G0/G1，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.110，P>0.05)，而兩組G0/G1低于常規(guī)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=66.62，P<0.05)；三組G2/M期分布比例，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.36，P>0.05)。

2.3胃癌MGC-803裸鼠移植瘤細(xì)胞在各組凋亡率及抑瘤率的情況成功構(gòu)建裸鼠移植瘤模型后，未出現(xiàn)裸鼠接種部位感染，無意外死亡裸鼠。常規(guī)組癌細(xì)胞裸鼠凋亡率為(25.98±1.61)%，抑瘤率為0.00%；雷替曲塞裸鼠的癌細(xì)胞凋亡率為(36.12±2.13)%，抑瘤率為49.34%；5-Fu組塞裸鼠的癌細(xì)胞凋亡率為(33.85±1.97)%，抑瘤率為40.32%。常規(guī)組凋亡率抑瘤率明顯低于雷替曲塞組與5-Fu組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=216.05，P<0.05)；而雷替曲塞組癌細(xì)胞凋亡率與抑瘤率明顯高于5-Fu組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.140，P<0.05)。且在治療過程中所有裸鼠精神狀態(tài)良好，未出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)的發(fā)生。

表2 胃癌MGC-803裸鼠移植癌細(xì)胞在

3 討 論

細(xì)胞增殖不受控制是惡性腫瘤最重要的特征之一，而大多數(shù)患者發(fā)生惡性腫瘤與細(xì)胞周期調(diào)控功能紊亂有關(guān)[7]。細(xì)胞凋亡與壞死是維持機體功能和形態(tài)所必須的，細(xì)胞凋亡與壞死不同，凋亡為機體正常生理或病理狀態(tài)下細(xì)胞發(fā)生的程序性的、自發(fā)的主動死亡過程[8]。組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)機制最重要的機制之一為調(diào)控細(xì)胞凋亡，一旦發(fā)生調(diào)控功能失常，易導(dǎo)致各種病理情況發(fā)生，如癌變、抗藥性[9,10]。細(xì)胞周期監(jiān)控機制受到破壞是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的無限增殖的主要原因，故臨床惡性腫瘤的治療主要為調(diào)控細(xì)胞凋亡[11]。大多數(shù)患者經(jīng)氟尿嘧啶類藥物(5-Fu、卡培他濱等)治療后均會發(fā)生嚴(yán)重心臟毒性，而雷替曲塞作為一種胸苷酸合成酶的特異性抑制劑用于治療后未有患者出現(xiàn)相關(guān)的心臟毒性，可用來代替氟尿嘧啶類藥物[12]。雷替曲塞可抑制細(xì)胞DNA的合成與胸苷酸合成酶的活性，同時可潴留在細(xì)胞內(nèi)長時間發(fā)揮抗腫瘤的作用，且治療后不良反應(yīng)輕，患者易于耐受[13]。

結(jié)合本文體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，雷替曲塞對人胃癌MGC-803細(xì)胞株抑制增殖及促進(jìn)凋亡作用顯著，可見雷替曲塞可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗胃癌的作用。根據(jù)干預(yù)后裸鼠體重、抑制瘤體積及瘤重等情況可了解，經(jīng)腹部注射雷替曲塞與腹部注射5-Fu的裸鼠體重、抑制瘤體積及瘤重均顯著低于經(jīng)腹腔注射生理鹽水裸鼠，表明經(jīng)腹部注射雷替曲塞與腹部注射5-Fu干預(yù)后的裸鼠治療可使瘤體變小，故裸鼠體重較輕。結(jié)合胃癌MGC-803裸鼠移植瘤細(xì)胞在各組細(xì)胞周期分布及凋亡率抑瘤率情況分析，腹部注射雷替曲塞裸鼠細(xì)胞凋亡率及抑瘤率均高于腹部注射5-Fu裸鼠，雷替曲塞可將人胃癌細(xì)胞胞株細(xì)胞S期的比例上升，從而將細(xì)胞進(jìn)程阻滯在G0/G1期，表明雷替曲塞對胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡具有誘導(dǎo)作用，可抑制人胃癌細(xì)胞生長。

綜合以上，胃癌患者給予雷替曲塞治療可抑制癌細(xì)胞的增殖，可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗胃癌的作用。

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StudyontheEffectandMechanismofInjectionofRaltitrexedonCancerCellsinGastricCancerPatients

MAShihua,SHINengsheng,etal

(ThePeople'sHosptalinLishuiDistrictofNanjing,JiangsuNanjing211200,China)

Objective:To investigate the effect and mechanism of injection of raltitrexed on cancer cells in gastric cancer patients.Methods84 nude mice were purchased to establish the human gastric cancer cell MGC-803 subcutaneous tumormodel，after successful modeling ,micewere randomly divided into 3 groups, the conventional group

intraperitoneal injection of saline, the raltitrexed group were given intraperitoneal injection of raltitrexed, the 5-Fu group were given intraperitoneal injection of 5-Fu, nude miceweight, tumor volume, tumorweight ,inhibition rate,apoptosis rate, cycle distribution of cancer cellsafter intervention were observed.ResultsNude miceweight, tumor volume ,tumor weight of the conventional groupwere significantly higher than those of the raltitrexed group and the 5-Fu group, the difference had statistical significance (P<0.05);The raltitrexed group'snude mice weight was higher than that of the 5-Fu group, the difference had no statistical significance (P>0.05), tumor volume, tumor weight of the raltitrexed group were lower than those of the 5-Fu group, the difference had statistical significance(P<0.05);The nude mice cancer cells S phase distribution of the conventional group was significantly higher than that of the raltitrexed group and the 5-Fu group, the difference had statistical significance(P<0.05); The S phase distribution of the raltitrexed group and the 5-Fu group had no significant difference, the difference hadno statistical significance (P>0.05);There was no significant difference between the raltitrexedgroup and the 5-Fu group in G0/G1 , the difference hadno statistical significance (P>0.05);G0/G1 phase distribution of the raltitrexed group and the 5-Fu group was lower than that of the conventional group, the difference had statistical significance (P<0.05); G2/M phrase distribution among the three groups has no obvious difference, the difference hadno statistical significance(P>0.05);The conventional group's cancer cell inhibition rate, apoptosis rate were significantly lower than those of the raltitrexed group and the 5-Fu group, the difference had statistical significance(P<0.05); While those of the raltitrexed group were significantly higher than those of the 5-Fu group, the difference had statistical significance (P<0.05).ConclusionAdoptingraltitrexed for gastric cancer patients has similaranti-tumor effect with 5-Fu, which can effectively inhibit the growth of human gastric cancer cell MGC-803 xenograft tumor in nude mice and induce apoptosis of cancer cells.

Raltitrexed; Gastric cancer; 5-Fu

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.10.024

1006-6233(2017)10-1667-04

施能勝， 卞元清2