杭州市冬春季大氣細顆粒物中多環芳烴的粒徑分布特征及細胞毒性研究*

陳金媛 劉柏辰 韓瀟倩 周慶華

(浙江工業大學環境學院，浙江 杭州 310014)

杭州市冬春季大氣細顆粒物中多環芳烴的粒徑分布特征及細胞毒性研究*

陳金媛 劉柏辰 韓瀟倩 周慶華#

(浙江工業大學環境學院，浙江 杭州 310014)

為了解杭州市大氣細顆粒物中多環芳烴(PAHs)的粒徑分布特征和主要來源，于2015年12月至2016年5月在杭州市某商住區采集了不同粒徑的大氣細顆粒物樣品，利用氣相色譜質譜聯用儀對其中的PAHs進行分析，并進行了細胞毒性試驗。結果表明，不同粒徑大氣細顆粒物中PAHs的總濃度冬季均明顯高于春季。冬春兩季的PAHs環數粒徑分布基本呈現出4環>5環>3環>6環>2環。通過特征比值法判定，杭州市大氣細顆粒物中的PAHs主要來源于燃燒源和機動車尾氣排放。細胞毒性試驗結果表明，粒徑越小的大氣細顆粒物對細胞的毒性作用越強，對細胞膜損傷程度越大。

大氣細顆粒物 多環芳烴 粒徑分布 細胞毒性

隨著城市化的進程加快，機動車保有量急劇增加，城市基礎建設深入開展，顆粒物污染已成為我國各城市大氣污染的首要問題。大氣顆粒物因比表面積大而容易吸附有毒有害物質，通過呼吸系統進入人體后會對人體健康造成不良影響[1-2]。多環芳烴(PAHs)是大氣顆粒物中一類常見的有機污染物，具有致癌、致畸、致突變性。近些年，國內的科研人員已對不同地區大氣顆粒物中的PAHs進行了相關研究[3-7]，但主要僅針對PM2.5和PM10。已有研究表明，大氣顆粒物對人體健康的負面影響不僅取決于其吸附的化學成分，而且與其粒徑大小有關[8]，粒徑越小可能的負面影響更大，因此研究大氣細顆粒物(粒徑小于2.5 μm)中PAHs的粒徑分布特征與細胞毒性具有重要的意義，然而目前對于不同粒徑大氣細顆粒物中的PAHs研究甚少。

杭州市作為浙江省省會，位于長江三角洲中心區域，經濟發展迅猛，城市規模日益擴大，給大氣環境帶來了巨大的壓力。因此，本研究在杭州市某商住區采集冬春兩季的不同粒徑大氣細顆粒物，分析其中的PAHs粒徑分布特征、來源和細胞毒性，為后續的大氣細顆粒物研究提供參考，為相關部門進行大氣污染防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采樣點位置為120°09′44.63″E，30°17′35.28″N，屬于商住區，采樣高度選擇距地面約15 m[9]，采樣時間為2015年12月至2016年5月。利用9級串聯低壓撞擊器(DLPI)連續采集不同粒徑的大氣細顆粒物樣品，采樣濾膜為鋁箔，采樣流量為10 L/min，每72 h收集一次樣品。雨雪天氣不進行采樣。

采樣前，鋁箔在索氏提取器中于60 ℃下提取16 h，置于恒溫((25±1) ℃)、恒濕(50%±5%)箱中平衡24 h以上，以去除本底值。使用賽多利斯CPA225D型十萬分之一精密電子天平稱量采樣前后的鋁箔，所有鋁箔均稱量兩次，保證兩次質量差小于0.04 mg，取平均值[10]。采樣后的鋁箔存放于6孔板中冷藏保存。

1.2 樣品預處理及測定

在樣品中加入回收率指示物(包括萘-D8、二氫苊-D10、菲-D10、-D12、苝-D12)，質量濃度均為2 μg/L，加入量為1 mL，用100 mL二氯甲烷∶正己烷(體積比，下同)=4∶1的混合液在索氏提取器中于65 ℃下提取16 h。提取液經R201型旋轉蒸發儀濃縮至5 mL以內，轉移至硅膠層析柱凈化。層析柱填充物從上到下依次為1 cm硫酸鈉、10 cm硅膠、10 cm氧化鋁，使用前進行活化。用70 mL 二氯甲烷∶正己烷=3∶7的混合液淋洗層析柱，淋洗液經旋轉蒸發儀濃縮至2 mL以內，轉移至樣品瓶，氮吹后加入質量濃度為10 μg/L的內標物六甲基苯200 μL，定容至1 mL，-20 ℃冷藏，待測。

運用Agilent 7890A/5975C型氣相色譜質譜聯用儀(GC/MS)測定不同粒徑大氣細顆粒物中的16種PAHs，分別是萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、熒蒽、芘、苯并[a]蒽、、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、苯并[a]芘、茚苯[1,2,3-cd]芘、二苯并[a,h]蒽、苯并[g,h,i]苝。色譜柱為Agilent DB-5MS毛細色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為氦氣(純度為99.99%)；進樣口溫度為300 ℃，不分流進樣，進樣量為1 μL；程序升溫：初溫50 ℃，保持2 min后以10 ℃/min升至180 ℃，再以6 ℃/min升至230 ℃，最后以3 ℃/min升至280 ℃，保持8 min；電離源為電子轟擊源(EI)，能量為70 eV，溫度為250 ℃；掃描方式為選擇離子掃描。

1.3 細胞毒性試驗

細胞毒性試驗選用傳代系細胞A549細胞，在含10%(質量分數，下同)血清的DMEM培養液中培養后，接種于96孔板上。然后置于37 ℃、含5%(質量分數，下同)CO2的培養箱中培養24 h，棄上清液，用含1%血清的DMEM培養液稀釋不同粒徑的大氣細顆粒物至1 μg/mL[11]，對照組用超純水代替大氣細顆粒物樣品。繼續培養24 h后，分別進行細胞存活率和細胞膜損傷試驗。由于粒徑為0.030～0.060、>0.060～0.108 μm的細顆粒物較少，本研究將兩個粒徑范圍的樣品合并后用于細胞毒性試驗。

細胞存活率試驗：每孔加入10 μL質量濃度為5 mg/mL的二苯基四氮唑溴鹽(MTT)溶液，于37 ℃、含5%CO2的細胞培養箱中培養4 h，棄上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，常溫放置約10 min，待其充分溶解后，用TECAN Infinite F50型酶標儀在570 nm下測定吸光度并計算細胞存活率[12]。

細胞膜損傷試驗：每孔加入26 μL基質緩沖液和5 μL輔酶Ⅰ(基質緩沖液和輔酶Ⅰ購自南京建成生物工程研究所)，混勻后在37 ℃水浴中加熱15 min，加入2,4-二硝基苯肼25 μL繼續加熱15 min，再加入0.4 mol/L的NaOH溶液250 μL，混勻后在室溫下放置5 min，用酶標儀在450 nm下測定吸光度，計算乳酸脫氫酶(LDH)釋放量，用于表征細胞膜損傷程度。

1.4 質量控制與質量保證(QA/QC)

采樣期間共做了5次全流程空白，均符合QA/QC要求。每個樣品平行測定3次，相對偏差均小于5%。每次進行樣品測定前重新校正標準曲線，樣品測試過程中每20個樣品測定1次標準溶液。空白加標回收實驗，除萘(58.7%)回收率略低外，其余15種PAHs在80%～110%范圍內，相對標準偏差小于8%，但均符合QA/QC要求。回收率指示物的回收率為64.6%～96.5%，相對標準偏差小于10%，符合QA/QC要求。目標化合物的定量經內標物六甲基苯校正。

2 結果與討論

2.1 PAHs總濃度的粒徑分布

采樣期間，杭州市某商住區冬春兩季16種PAHs總濃度的粒徑分布如圖1所示。由圖1可知，不同粒徑的大氣細顆粒物中16種PAHs的總質量濃度冬季為2.28～4.38 ng/m3，春季為0.45～1.05 ng/m3，冬季明顯高于春季。經方差分析，冬春各個季節內不同粒徑范圍的大氣細顆粒物PAHs濃度分布并無顯著差異(P>0.05)。這是由于杭州市受亞熱帶季風氣候的影響，四季分明。據統計，杭州市冬季平均氣溫為7.3 ℃，春季為17.2 ℃。冬季氣溫較低，更易于產生逆溫天氣，污染物難以擴散，而春季大氣對流活動增強，有利于污染物擴散。

圖1 PAHs總質量濃度在大氣細顆粒物中的粒徑分布Fig.1 Size distribution of PAHs’ total concentrations in fine atmospheric particulate matter

圖2 PAHs環數在大氣細顆粒物中的粒徑分布Fig.2 Size distribution of PAHs’ aromatic rings in fine atmospheric particulate matter

2.2 PAHs環數的粒徑分布

杭州市大氣細顆粒物中PAHs環數的粒徑分布如圖2所示。冬春兩季PAHs環數粒徑分布特征基本一致，平均質量分數大致呈現出4環>5環>3環>6環>2環。4環PAHs在不同粒徑的大氣細顆粒物中所占質量分數冬季為37.99%～63.11%、春季為35.06%～46.11%，5環PAHs冬季為16.41%～29.45%、春季為21.18%～43.61%。一般情況下，低環(2環和3環)的PAHs容易揮發，顆粒物中含量較小，主要以氣態形式存在于大氣中；4環PAHs為半揮發性有機物，在氣態和顆粒物中都有存在；而高環(5環和6環)的PAHs揮發性較差，主要吸附在大氣顆粒物的表面[13]。高環的PAHs比低環PAHs有更強的致癌性，對人體健康危害更大[14]。

2.3 大氣細顆粒物中PAHs來源分析

除少數PAHs由動植物合成外，大部分PAHs來源于化石燃料和生物質的燃燒、機動車尾氣排放等。由于燃料種類和燃燒條件的不同，生成的PAHs種類和相對含量也有差別。對PAHs進行來源分析時，特征比值法應用比較廣泛。本研究亦采用特征比值法進行大氣細顆粒物中PAHs的來源解析。前人在總結大量PAHs源數據的基礎上，分析得出了蒽/(蒽+菲)、熒蒽/(熒蒽+芘)、苯并[a]蒽/(苯并[a]蒽+)、茚苯[1,2,3-cd]芘/(茚苯[1,2,3-cd]芘+苯并[g,h,i]苝)、芘/苯并[a]芘的判定依據[15-17]。

對不同粒徑的大氣細顆粒物中PAHs進行特征比值分析，結果如表1所示。總體而言，杭州市冬春兩季大氣細顆粒物中PAHs主要來源于燃燒源和機動車尾氣排放。這符合杭州市及周邊城市機動車保有量較大、燃煤鍋爐未全面淘汰或未改造完成的現狀。

事實上，PAHs的環數就能間接反映污染物的來源。通常，2～4環PAHs主要來源于機動車尾氣排放，而5～6環PAHs多來源于燃燒源。從圖2同樣可以看出，杭州市大氣細顆粒物中PAHs的來源為燃燒源和機動車尾氣排放的綜合污染。

2.4 細胞毒性研究

細胞存活率試驗結果如圖3(a)所示，當大氣細顆粒物粒徑為0.030～0.400 μm時，細胞存活率明顯低于粒徑為>0.400～2.500 μm時，說明大氣細顆粒物粒徑越小，其細胞毒性越強。

此外，本研究通過測定細胞上清液中LDH釋放量來間接反映細胞膜的受損程度，試驗結果如圖3(b)所示。LDH釋放量隨粒徑增大而降低。當顆粒物粒徑為>1.600～2.500 μm時，LDH釋放量最低，為755 U/L；顆粒物粒徑為0.030～0.108 μm時，LDH釋放量最高，為840 U/L。這表明，大氣細顆粒物能夠引起細胞膜的損傷，并且損傷的程度與顆粒物的粒徑有關，顆粒物的粒徑越小對細胞膜的損傷越大[18-19]。

表1 不同粒徑大氣細顆粒物中PAHs的特征比值

注：1)≤0.1來源于成巖作用，>0.1來源于燃燒源；2)<0.20主要來源于成巖作用，0.22～0.55主要來源于汽油燃燒，0.38～0.64主要來源于柴油燃燒，>0.50主要來源于煤燃燒；3)<0.4來源于成巖作用，0.4～0.5來源于石油燃燒，>0.5來源于煤/生物質燃燒；4)<0.2來源于成巖作用，0.2～0.5來源于石油/汽油燃燒，>0.5來源于煤/生物質燃燒；5)<1來源于非交通源，1～6來源于機動車尾氣排放。

圖3 細胞毒性研究結果Fig.3 Results of cell toxicity

3 結 論

杭州市某商住區大氣細顆粒物中，PAHs總濃度冬季顯著高于春季，但各個季節內不同粒徑的細顆粒物中PAHs濃度分布并無顯著差異。兩個季節的PAHs環數粒徑分布基本呈現出4環>5環>3環>6環>2環。杭州市大氣細顆粒物中PAHs主要來源于燃燒源和機動車尾氣排放。粒徑越小的大氣細顆粒物對細胞的毒性作用越強，對細胞膜損傷程度越大，需要特別關注。

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SizedistributionandcelltoxicityofpolycyclicaromatichydrocarbonsinfineatmosphericparticulatematterduringwinterandspringinHangzhou

CHENJinyuan，LIUBaichen，HANXiaoqian，ZHOUQinghua.

(CollegeofEnvironment，ZhejiangUniversityofTechnology，HangzhouZhejiang310014)

To investigate the size distribution and main sources of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in fine atmospheric particulate matter in Hangzhou,samples were collected in a commercial and residential area in Hangzhou from December 2015 to May 2016. PAHs were detected using gas chromatography/mass spectrometry. Cell toxicity tests were also conducted. Results showed that total concentrations of PAHs in different size were all higher in winter than in spring. Furthermore,it was found that the size distribution of PAHs’ aromatic rings almost all showed 4-ring > 5-ring > 3-ring > 6-ring > 2-ring. The diagnostic ratios revealed that the PAHs in Hangzhou mainly originated from the pyrogenic sources and vehicle exhaust emission. Finally,it was demonstrated that the finer particulate matter possessed the higher cell toxicity and cytomembrane damage.

fine atmospheric particulate matter; polycyclic aromatic hydrocarbons; size distribution; cell toxicity

10.15985/j.cnki.1001-3865.2017.02.001

2016-12-15)

陳金媛，女，1963年生，博士，教授，主要從事環境污染化學及污染毒理學研究。#

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*國家自然科學基金資助項目(No.21177114)；浙江省自然科學基金資助項目(No.LZ15B070001)。