曲美他嗪對慢性心力衰竭大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

張夢云 楊曉歐 李秀華 馮翔宇 彭玉娟

(承德醫學院附屬醫院，河北 承德 067000)

1 滄州市人民醫院 2 泰安市第一人民醫院

曲美他嗪對慢性心力衰竭大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

張夢云 楊曉歐 李秀華 馮翔宇1彭玉娟2

(承德醫學院附屬醫院，河北 承德 067000)

目的研究曲美他嗪(TMZ)對慢性心力衰竭(CHF)大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax表達的影響。方法通過縮窄腎上腹主動脈建立CHF大鼠模型，選擇30只雄性Wistar 大鼠隨機分為假手術組、模型組、TMZ組，每組10只。監測各組心臟血流動力學參數，采用蘇木素-伊紅(HE)染色觀察各組腎臟形態結構改變，TUNEL法檢測各組腎臟組織細胞凋亡指數(AI)；免疫組織化學法(SP法)檢測各組腎臟組織中Bcl-2與Bax蛋白的表達水平，RT-PCR法檢測Bcl-2、Bax mRNA 含量。結果與模型組比較，TMZ組大鼠腎小管排列整齊，腎小管細胞水腫、脫落減少；AI和Bax蛋白、 mRNA表達水平顯著下降(P<0.01)；Bcl-2蛋白、 mRNA表達水平明顯升高(P<0.01)。結論CHF時應用TMZ可通過抑制細胞凋亡保護腎功能，進而改善心功能。

曲美他嗪；腎臟；細胞凋亡；Bcl-2；Bax

慢性心力衰竭(CHF)時腎臟可能存在大量細胞凋亡，腎臟細胞凋亡是腎功能不全發生的重要原因之一〔1，2〕。腎功能不全在一定程度上影響并決定著CHF患者的預后，大大增加了心血管疾病的發病率和死亡率〔3〕。因此早期使用藥物干預可能抑制或逆轉細胞的損傷，進一步改善心腎功能。曲美他嗪(TMZ)是臨床有效抗心肌缺血的新型代謝類藥物〔4〕，同時TMZ還可能通過阻止線粒體介導的凋亡通路抑制細胞凋亡發生〔5〕。本文觀察CHF時腎小管上皮細胞凋亡情況及TMZ的抗凋亡及保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗試劑 鹽酸曲美他嗪(商品名：萬爽力)，由瑞陽制藥有限公司生產；TUNEL試劑盒購自美國羅氏(Roche)公司；Bax、Bcl-2兔抗多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；免疫組織化學試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司；Bax和Bcl-2引物與Trizol購自美國Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。

1.2動物模型的制備及分組 30只清潔級Wistar大鼠，體質量200～220 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，全部大鼠均適應性喂養1 w，隨機分為假手術組、模型組和TMZ組，每組10只，模型組和TMZ組大鼠均采用腎上腹主動脈縮窄術復制CHF模型〔6〕，術后連續3 d經腹腔注射給予20萬U/d青霉素。術后常規喂養4 w，大鼠逐漸出現呼吸、心跳加快、精神萎靡、食欲減退等表現。檢測血流動力學參數：左心室舒張末壓(LVEDP)≥15 mmHg，標志CHF模型建立成功。假手術組大鼠只分離腹主動脈，不予結扎。TMZ組給予TMZ 10 mg·kg-1·d-1，假手術組及模型組連續4 w給予等量生理鹽水灌胃〔7〕。

1.3血流動力學參數監測 終止大鼠觀察時檢測各組大鼠質量，通過腹腔進行注射麻醉，經右頸總動脈逆行插管至左心室，通過多導電生理記錄儀監測各實驗對象的LVEDP及左室內壓上升與下降最大速率(±dp/dtmax)，準確詳細記錄各組大鼠實驗數據。

1.4腎臟組織形態學觀察 取新鮮大鼠腎臟組織，用4%多聚甲醛固定后，進行常規的脫水、透明、石蠟包埋、切片、二甲苯脫蠟、梯度酒精下行至水、蘇木素-伊紅(HE)染色、梯度酒精上行脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，在400倍光學顯微鏡下觀察各組大鼠腎臟組織的形態結構變化。

1.5腎臟組織細胞凋亡指數(AI)的檢測 采用TUNEL法檢測腎臟組織細胞凋亡情況，將腎組織經常規固定、脫水、石蠟包埋、切片，切厚5 μm，嚴格按照TUNEL染色試劑盒說明書進行操作，在200倍熒光顯微鏡下進行觀察并計數，每個標本隨機選取6個視野觀察，分別對細胞凋亡數和細胞總數進行計數并求其平均值，計算腎臟組織AI。

1.6SP法檢測腎臟組織Bcl-2、Bax蛋白表達 腎組織石蠟切片置于二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，蒸餾水洗10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)液洗10 min，置入3%H2O2-甲醛溶液37℃ 30 min孵育清除內源性過氧化氫酶活性，采用微波法進行抗原修復，PBS浸泡15 min，滴加正常山羊血清37℃ 30 min，后加Bcl-2、Bax一抗(濃度均為1∶75)，4℃過夜，第2天37℃ 30 min復溫，加二抗37℃ 40 min，加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液室溫37℃ 40 min，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，以PBS代替一抗作為陰性對照。使用400倍光學顯微鏡觀察并拍照，后用Imagepro Plus軟件進行分析，以陽性表達產物面積與視野總面積的比值表示對應抗體相對表達含量。

1.7RT-PCR檢測Bcl-2、Bax mRNA表達 嚴格按照Trizol說明書提取各組大鼠腎組織總RNA，分別采用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計法測定總RNA的純度和濃度。大鼠Bcl-2引物序列：上游5′-GACGAGAAGTGCTATTGGT-3′，下游5′-TCAGGCTGGAAGGAGAAGAT-3′，擴增片段為205 bp；Bax引物序列：上游5′-TTTCATCCAGGATCGAGCAG-3′，下游5′-CAAAGTAGAAGAGGGCAACCAC-3′，擴增片段為263 bp；β-actin 作為內參，上游引物序列：5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物序列：5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3′，擴增片段為452 bp。PCR擴增條件：94℃，2 min；94℃，30 s；50℃～60℃，30 s；72℃，30 s第二步起循環。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳并攝像，使用Gel Pro Analyzer統計軟件進行定量分析，以各組Bcl-2、Bax 吸光度(A)與其對應的β-actin(A)的比值分別表示各組Bcl-2、Bax mRNA表達水平。

1.8統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件進行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組血流動力學指標比較 與假手術組比較，模型組LVEDP顯著升高(P<0.01)，±dp/dtmax明顯降低(P<0.01)，與模型組相比，TMZ組LVEDP明顯下降(P<0.01)，±dp/dtmax顯著升高(P<0.01)。見表1。

表1 各組血流動力學指標比較

與假手術組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01，下表同

2.2各組腎臟組織病理學觀察 假手術組大鼠腎小球與腎小管形態結構正常、排列整齊；模型組大鼠腎小管結構排列紊亂，上皮細胞腫脹、脫落明顯，提示CHF時腎臟組織有所損害；TMZ組腎小管結構排列整齊，細胞脫落現象明顯減輕。見圖1。

圖1 各組腎臟組織病理學觀察(HE，×400)

2.3各組腎小管上皮細胞Bcl-2、Bax蛋白表達 Bcl-2、Bax蛋白陽性表達成分是分布于胞質內的棕黃色顆粒，與假手術組比較，模型組中Bcl-2表達明顯減弱，而Bax表達顯著增強(P<0.01)，提示腎組織細胞凋亡增多；TMZ組與模型組比較，Bcl-2表達有所增加，而Bax表達強度減弱(P<0.01)。見表2，圖2。

2.4各組腎臟組織AI 熒光顯微鏡下，被激發出綠色熒光的細胞為凋亡細胞，假手術組僅有少量細胞凋亡；與假手術組比較，模型組細胞凋亡數目顯著增多(P<0.01)，顯示CHF時腎臟組織存在大量凋亡細胞；TMZ組中細胞凋亡數量比模型組明顯減少(P<0.01)。見表2，圖3。

2.5各組大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax mRNA表達 與假手術組比較，模型組Bcl-2 mRNA表達水平顯著下降，Bax mRNA表達水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，TMZ組Bcl-2 mRNA表達水平顯著上升，Bax mRNA表達水平明顯降低(P<0.01)。見表2，圖4，圖5。

表2 各組腎臟組織AI、Bcl-2與Bax蛋白及mRNA表達比較

圖2 各組腎臟組織Bcl-2、Bax蛋白表達(DAB，×400)

圖3 各組腎臟組織細胞凋亡情況(TUNEL，×200)

M：Marker；1，4：假手術組；2，5：模型組；3，6：TMZ組；下圖同圖4 各組大鼠腎臟組織Bcl-2 mRNA的表達

圖5 各組大鼠腎臟組織Bax mRNA的表達

3 討 論

研究顯示CHF時低心排血量、缺氧、神經體液的過度激活、炎癥反應和氧化應激反應增強，可以引起腎臟細胞凋亡，最終導致腎衰竭〔8，9〕。Schumer等〔10〕指出腎組織缺血可能造成大量細胞丟失，而該過程與細胞壞死明顯不同，是由凋亡介導的。

腎臟在受到各種損傷后往往會發生腎小管細胞凋亡，如燒傷，缺血，輻射，創傷或毒性損傷，早期及時干預腎臟組織繼發的細胞凋亡可能是一個潛在的保護途徑〔11〕。在線粒體凋亡通路中，細胞在Ca2+超載、一氧化氮(NO)、氧自由基大量形成等因素的刺激下，線粒體膜通透性轉運孔(mPTP)會開放，使存在于線粒體內外膜間隙的細胞色素C和凋亡因子釋放至細胞質內引起細胞凋亡的發生〔12〕。mPTP開放有賴于Bcl-2蛋白家族的調控，Bcl-2蛋白家族主要有抗細胞凋亡蛋白(如Bcl-2和Bcl-xL)和促細胞凋亡蛋白(如Bax和Bak)，而mPTP是否激活有賴于Bcl-2和Bax蛋白含量的比值，當接收到凋亡信號后Bax將從細胞質易位到線粒體外膜形成大量Bax/Bax同源二聚體，使mPTP開放，導致Cyt-C和凋亡因子釋放〔13〕。而Bcl-2表達上調可形成結構相對穩定的Bcl-2/Bax異源二聚體，使大量同源二聚體解離，從而抑制細胞凋亡〔14〕。Bcl-2的過度表達還可引起細胞核谷胱甘肽聚集，影響核內氧化還原狀態，阻止胞內Ca2+流動，阻斷凋亡進程〔15〕。

TMZ對心臟和腎臟均可產生一定的保護作用〔16〕。TMZ對細胞的保護作用機制主要有：①TMZ可以抑制mPTP開放：TMZ通過增強呼吸鏈中輔酶Ⅰ活性，抑制活性氧自由基(ROS)的生成，繼而減輕線粒體膜的損傷和限制mPTP的開放，從而抑制細胞色素C的釋放，防止細胞凋亡的發生〔4，5〕。②TMZ可選擇性抑制線粒體長鏈3-酮酰輔酶A硫解酶，從而減少脂肪酸氧化，促進葡萄糖的有氧氧化，維持三磷酸腺苷(ATP)的產生和缺血細胞的能量代謝，減少氧化應激相關的游離酸產生的不利影響〔5，17〕。③TMZ能夠減少細胞內Na+、Ca2+超載，抑制中性粒細胞浸潤和氧自由過度生成，具有抗氧化、抗凋亡等多種細胞保護作用〔18〕。ROS生成增多將造成線粒體膜電位勢能下降從而導致mPTP開放，引起細胞凋亡〔19〕。因此，根據TMZ對細胞保護的相關作用機制，它可以通過保護腎小管缺血上皮細胞線粒體膜結構，加強能量代謝，降低H+、Na+、Ca2+在細胞內的聚集，減少氧自由基生成，從而減少細胞凋亡。

本研究表明TMZ在改善心功能的同時，可能通過抗氧化應激作用抗腎小管細胞凋亡而改善腎功能。TMZ抗細胞凋亡的分子機制可能與凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax密切相關。

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河北省衛生計生委資助課題(No.20110180)

李秀華(1967-)，女，教授，博士，碩士生導師，主要從事慢性心力衰竭病理生理研究。

張夢云(1988-),女，在讀碩士，主要從事慢性心力衰竭病理生理研究。

R541.6

A

1005-9202(2017)20-4982-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.012

〔2017-07-16修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)