地黃飲子含藥血清對大鼠BMSCs與NSCs共培養影響轉歸的研究

武博文 ，武密山 ，2*，王慧娜 ，郭金棟 ，高維娟 ，2，王 茹 ，韓紅偉 ，師旭亮

（1.河北中醫學院，河北 石家莊 050200；2.河北省心腦血管病中醫藥防治重點實驗室，河北 石家莊 050091；3.承德醫學院，河北 承德 067000）

地黃飲子含藥血清對大鼠BMSCs與NSCs共培養影響轉歸的研究

武博文1，武密山1，2*，王慧娜3，郭金棟1，高維娟1，2，王 茹1，韓紅偉1，師旭亮1

（1.河北中醫學院，河北 石家莊 050200；2.河北省心腦血管病中醫藥防治重點實驗室，河北 石家莊 050091；3.承德醫學院，河北 承德 067000）

目的探討以升麻為藥引子的地黃飲子（CRD）含藥血清對經過骨髓間充質干細胞（BMSCs）共培養后的大鼠神經干細胞（NSCs）的存活和分化的影響。方法 建立BMSCs與NSCs共培養模型，在共培養體系中加入CRD含藥血清，從培養第3天開始分別進行5-溴-2-脫氧尿嘧啶（BrdU）和神經元特異性烯醇化酶（NSE）、膠質細胞纖維酸性蛋白（GFAP）、神經元特異性標志物微管相關蛋白2（MAP-2）、少突膠質細胞特異性表達蛋白標志物（MBP）免疫細胞化學雙染色。采用流式細胞儀檢測NSCs的存活率，利用細胞免疫熒光和Western blot法鑒定NSCs的分化情況，比較NSCs的存活率和分化率，分析CRD含藥血清對共培養后NSCs的存活及分化的影響。結果 與生理鹽水對照組相比，中、高濃度CRD含藥血清在BMSCs與NSCs共培養體系中第7天能顯著提高NSCs存活率和NSE、GFAP、MAP-2、MBP活性（P＜0.01）。結論 CRD 含藥血清在BMSCs與NSCs共培養體系中能促進NSCs有效分化和提高NSCs存活率。

骨髓間充質干細胞；神經干細胞；藥引子；地黃飲子；含藥血清；神經樣細胞

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是損傷脊髓平面以下的感覺及運動功能喪失的中樞神經系統疾病[1]，治療方法主要通過細胞移植[2]。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是理想的種子細胞[3]，不僅可向成骨細胞等中胚層細胞定向分化，而且在特定條件下還可向外胚層神經元樣細胞、星形膠質樣細胞和少突膠質樣細胞分化[4]。神經干細胞（neural stem cells，NSCs）有多向分化潛能，能分化為特定的神經細胞[5]。BMSCs與NSCs因其特有的生物學特征成為細胞移植的主要來源[6]，其分化受微環境的影響，亦能各自分泌因子，有關將二者共培養的作用機制研究少見報道。前期研究表明，升麻苷能透過血腦屏障，可調節腦缺血興奮性氨基酸神經遞質，對神經元損傷有保護作用[7]。本研究將升麻（Cimicifuga heracleifolia Kom）加入地黃飲子（Rehmannia decoction，RD），制備以升麻為藥引子的地黃飲子（簡稱CRD）含藥血清，探索CRD對BMSCs與NSCs共培養中NSCs存活及分化的影響，以期為干細胞移植治療腦和脊髓損傷提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥物 地黃飲子來源于宋朝劉河間的《黃帝素問·宣明論方》，藥物組成：熟干地黃24g，巴戟天12g，山萸肉12g，石斛12g，肉蓯蓉12g，熟附子9g，五味子6g，肉桂6g，白茯苓9g，麥冬12g，石菖蒲 9g，遠志 6g，薄荷 5g，生姜 3g，大棗6g。另備升麻12g作為藥引子。地黃飲子加上具有“升清陽”作用的升麻，參照文獻[8]，水提醇沉，制備CRD，每毫升藥液含生藥5.5g，相當于臨床用量的20倍。同法制備RD組，生藥含量同CRD組。

1.1.2 主要試劑 DMEM低糖細胞培養液 （美國Hyclone公司）；DMEM/F12細胞培養液（美國Gibco公司）；小鼠抗兔BrdU單克隆抗體（Sigma公司）；兔抗大鼠NSE多克隆抗體（Boster biotechnology公司）；小鼠抗大鼠神經膠質細胞酸性纖維蛋白 （glial fibrillaryacidic protein，GFAP）單克隆抗體 （Sigma公司）；兔抗小鼠抗微管相關性蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP-2）單克隆抗體 （Sigma公司）；兔抗大鼠細胞髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）單克隆抗體（Sigma公司）；FITC 標記的山羊抗小鼠IgG抗體（美國Santa Cruz公司）；包被用左旋氏多聚賴氨酸 （Poly-L-Lysine，Sigma公司）；AnnexinV-PI凋亡試劑盒（美國BD公司）；SABC小鼠/兔免疫組化染色試劑盒、雙染試劑盒Histostain TM-DS kit（北京中山生物技術有限公司）；ECL蛋白顯影液試劑盒、Transwell培養板（美國Corning公司）；Hoechst 33442免疫熒光一抗稀釋液、免疫熒光二抗稀釋液、青/鏈霉素溶液（×100）、即用型胰蛋白酶細胞消化液、抗熒光淬滅封片液（上海碧云天公司）。

1.1.3 實驗動物 清潔級SD大鼠新生3d雌鼠3只，清潔級10月齡雌性SD大鼠18只，體質量（351±12）g，購自河北醫科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（冀）2013-1-003，合格證號：2016A018。

1.2 方法

1.2.1 大鼠含藥血清的制備 18只10月齡SD大鼠，隨機分為3組（每組6只）：一組為服CRD藥組，按1g/kg體質量灌服CRD，每天1次，連續3d。另一組為對照組，灌服同容量的生理鹽水。再一組為服RD藥組，按1g/kg灌服RD，每天1次，連續3d。第3次灌胃1.5h后，所有大鼠均在乙醚麻醉下自腹主動脈抽取血液，同組合并后離心獲取血清，血清在56℃滅活30min，0.22 μm濾膜過濾除菌后，參照本實驗室方法，按“通法方案”[8]，分別制備 0.1 μmol/L、1μmol/L、10 μmol/L 低、中、高劑量濃度的CRD含藥血清和 1 μmol/L劑量濃度的RD含藥血清及生理鹽水對照血清。

1.2.2 體外分離和培養大鼠BMSCs 參照本實驗室全骨髓貼壁法分離BMSCs[9]，從大鼠股骨骨髓中分離BMSCs，培養基由含100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素及10% 胎牛血清的DMEM組成，放置于含5%CO2、37℃恒溫培養箱中，每隔2d更換培養液。待細胞鋪滿培養瓶后，進行細胞傳代。每次傳代用0.25%胰蛋白酶（0.1mL/cm2）消化2min，細胞傳至第3代后，利用流式細胞儀檢測分析細胞表面特異性標志物（CD29、CD34、CD90），并結合細胞形態學分析，證實所培養的細胞為大鼠BMSCs。

1.2.3 體外分離和培養大鼠NSCs 取SD新生雌鼠，頸椎脫臼法處死，浸泡在75%酒精中5min后斷頭，依次分離出全腦組織并將腦膜及殘余血管剝除。用剪刀充分剪碎全腦組織，放入1mL即用型胰蛋白酶消化液，放置于恒溫培養箱中，5min后加入NSCs培養液終止消化，轉移至篩網，過濾為細胞懸液，轉至離心管，1 000r/min離心5min。加入完全培養基，放置于含5%CO2、37℃恒溫培養箱中，每隔2d采取半量換液法更換培養基1次，培養傳代至第3代后，利用免疫細胞化學熒光檢測NSCs特異性蛋白 （Nestin巢蛋白），證實所培養細胞為大鼠NSCs。NSCs移植前24h用10mg/L的5-溴-2-脫氧尿嘧啶（BrdU）標記NSCs細胞。

1.2.4 BMSCs-NSCs體外共培養體系的建立 參照本實驗室方法[8]，對96孔細胞培養板進行改裝（圖1）。在距培養孔底部2mm的地方打孔（直徑 4mm），使相鄰的4孔相通，中間加一層0.45 μm的隔膜，隔膜與培養板接觸之處用質量分數3%的瓊脂糖凝膠密封，防止左右兩室的細胞混雜，只有培養上清可以經過隔膜相通。將制備好的培養板置于紫外線燈下照射消毒，備用。

將第3代BMSCs以1×106個/mL的細胞密度接種到 96孔細胞培養板的BMSCs培養室；在培養板的NSCs培養室中加入密度為1×103個/mL的第2代NSCs；加入培養基，漫過通道孔，使兩側培養上清相通；每小時將培養板傾斜1次，促進雙側上清交流，建立大鼠BMSCs與NSCs的共培養體系，共培養12d。

1.2.5 含藥血清干預方法與分組 待上述BMSCs-NSCs的共培養體系細胞同步化后，實驗共分5組，分別為：對照組（normal，加入與L-CRD組同質量濃度的生理鹽水血清），CRD含藥血清低劑量組 （LCRD，加入0.1 μmol/L的CRD含藥血清）、CRD含藥血清中劑量組（M-CRD，加入1 μmol/L的CRD含藥血清）、CRD含藥血清高劑量組 （H-CRD，加入10 μmol/L的CRD含藥血清），RD含藥血清組（RD，加入1 μmol/L的RD含藥血清），每組均設10個平行培養孔，每孔加入DMEM培養液200 μL，每隔2d換液1次。

圖1 BMSCs-NSCs體外共培養體系示意圖

1.3 觀察指標及檢測方法

1.3.1 細胞分化檢測 將各組BMSCs-NSCs的共培養體系中NSCs培養室的NSCs，分別于第3天至第12天用質量濃度為0.25g/L胰蛋白酶消化，1×105個/mL接種于經0.1%多聚賴氨酸包被的玻片，各組貼壁培養鋪滿細胞后，用PBS洗3次，常溫下用免疫熒光染色固定液固定20min，0.1%Triton X-100中孵育20min，用正常山羊血清封閉液于37℃恒溫培養箱中封閉1h，將免疫熒光一抗抗體MAP-2、MBP、GFAP、NSE 抗體 1∶100 稀釋混合均勻后分別依次加入各培養孔內，在4℃冰箱條件下孵育過夜；后加入TRITC 標記山羊抗兔IgG（1∶100）及FITC標記的山羊抗小鼠IgG抗體（1∶100），于37℃恒溫培養箱內避光孵育1h；Hoechst染色5min后PBS漂洗3次，每次5min。按照試劑盒說明書步驟分別進行BrdU和神經元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、膠質細胞纖維酸性蛋白（GFAP）、神經元特異性標志物微管相關蛋白2（MAP-2）、少突膠質細胞特異性表達蛋白標志物（MBP）免疫熒光化學雙染色，以確定神經元細胞、膠質細胞和少突膠質細胞。抗熒光淬滅封片液封片后用免疫熒光顯微鏡觀察。陽性細胞為紅色細胞核和藍色細胞漿，2種特征均具備為雙陽性細胞。倒置顯微鏡下每孔隨機讀取10個不同的視野，每組40個視野，采樣計數平均每個視野陽性細胞數，結果以陽性表達細胞的百分比表示。以培養時間為橫軸，細胞數為縱軸，描繪細胞分化曲線。

1.3.2 對NSCs存活率影響測定 將各組BMSCs-NSCs的共培養體系中NSCs培養室的NSCs計數后，取細胞懸液1mL，1 000r/min離心4min，去除上清液后加入100 μL的Binding Buffer，重懸細胞后，加入5 μL經熒光標記的Annexin-V試劑，充分混勻，避光條件下孵育20min，加入5 μL的PI試劑后避光下孵育5min，取400 μL的細胞重懸液，按照AnnexinV-PI細胞凋亡試劑盒步驟，流式細胞儀測定誘導凋亡后的NSCs的存活率。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 BMSCs-NSCs共培養的觀察

M-CRD、H-CRD 組 BMSCs很快貼壁，BMSCs體積縮小并分化成帶突起的神經元樣細胞和膠質細胞，約2d可見有神經細胞從神經球中呈放射狀伸出軸突，3d后在BMSCs表面的大部分神經球變成散在的單個細胞，向四周遷徙。L-CRD組、RD組第3天時才可見少量帶突起的神經元樣細胞和膠質細胞。Normal組中未見到細胞變形。

2.2 對NSCs分化的影響

2.2.1 CRD 含藥血清對大鼠 BMSCs-NSCs 體外共培養NSE的影響 與Normal組相比，L-CRD組和RD含藥血清組NSE的雙陽性NSCs無顯著性差異（P＞0.05）。M-CRD 組、H-CRD 組 NSE 的雙陽性NSCs在第7天分別與Normal組、RD含藥血清組相比，均明顯升高（P＜0.01）。見圖2。

圖2 不同劑量組CRD含藥血清對大鼠BMSCs-NSCs體外共培養NSE的影響

2.2.2 CRD 含藥血清對大鼠 BMSCs-NSCs 體外共培養GFAP的影響 與Normal組相比，L-CRD組和RD含藥血清組GFAP的雙陽性NSCs無顯著性差異（P＞0.05）。M-CRD 組、H-CRD 組 GFAP 的雙陽性NSCs在第7天分別與Normal組、RD含藥血清組相比，均明顯升高（P＜0.01）。見圖3。

圖3 不同劑量組CRD含藥血清對大鼠BMSCs-NSCs體外共培養GFAP的影響

2.2.3 CRD 含藥血清對大鼠 BMSCs-NSCs 體外共培養MAP2的影響 與Normal組相比，L-CRD組和RD含藥血清組MAP2的雙陽性NSCs無顯著性差異（P＞0.05）。M-CRD 組、H-CRD 組 MAP2 的雙陽性NSCs在第7天分別與Normal組、RD含藥血清組相比，均明顯升高（P＜0.01）。見圖4。

圖4 不同劑量組CRD含藥血清對大鼠BMSCs-NSCs體外共培養MAP2的影響

2.2.4 CRD含藥血清對大鼠 BMSCs-NSCs體外共培養MBP的影響 與Normal組相比，L-CRD組和RD含藥血清組MBP的雙陽性NSCs無顯著性差異（P＞0.05）。M-CRD 組、H-CRD 組 MBP 的雙陽性NSCs在第7天分別與Normal組、RD含藥血清組相比，均明顯升高（P＜0.01）。見圖5。

圖5 不同劑量組CRD含藥血清對大鼠BMSCs-NSCs體外共培養MBP的影響

2.3 對NSCs存活率的影響

與Normal組相比，L-CRD組和RD含藥血清組NSCs存活率無顯著性差異（P＞0.05）。M-CRD組、HCRD組NSCs存活率在第7天分別與Normal組、RD含藥血清組相比，均明顯升高（P＜0.01）。見圖6。

圖6 不同劑量組CRD含藥血清對大鼠BMSCs-NSCs體外共培養存活率的影響

3 討論

神經元特異性烯醇化酶是烯醇化酶的一種同工酶，主要存在于大腦神經元和神經內分泌細胞內并參與糖酵解，是糖原酵解途徑中甘油分解最后的酶，NSE是神經元損傷的標志物[10]。正常情況下，血液中的NSE含量比腦組織內低30倍。當腦組織由于缺血、中毒或外傷時，細胞膜完整性遭到破壞，NSE釋放出來進入腦脊液，由于血腦屏障破壞而進入血液循環。NSE與學習、記憶及認知能力有關[11]，認知障礙程度與血清NSE呈負相關[12]。

星形膠質細胞（astrocyte，AS）是大腦中數量眾多的細胞，與中樞神經系統（central nervous system，CNS）的內環境穩定、突觸傳遞等病理、生理過程密切相關[13]，在神經元的發育、突觸連接的形成中有重要作用[14]。膠質纖維酸性蛋白（GFAP）是星形膠質細胞的骨架蛋白及特異性標志物，反映細胞激活和膠質化程度，可作為腦損傷后星型膠質細胞活化及增殖的標志[15]。中樞神經系統受損時星形膠質細胞反應性增生，GFAP水平上調[16]。GFAP表達的增多有正、反兩方面的作用：一方面活化的星型膠質細胞膜上有5-羥色胺、γ-氨基丁酸等受體，具有維持腦損傷后內環境的穩定、神經細胞的可塑性作用[17]：另一方面活化的星型膠質細胞可產生有神經毒性作用的細胞因子，釋放細胞毒性物質和炎癥介質，加重神經組織的損傷[18]。

神經元內存在兩種高分子量的微管相關蛋白（MAPs），即 MAP1 和 MAP2，MAP2 主要存在于神經元的胞體和樹突中，且在樹突中的含量多于胞體，作為神經元的標志蛋白，MAP2是神經元細胞骨架蛋白，與微管蛋白形成微管，同肌動蛋白、微絲等相互作用構成細胞骨架[19]，維持微管力學穩定，參與突起生長、胞漿蛋白運輸、神經元塑形[20]。MAP2免疫活性下降可造成微管堆積，影響細胞骨架的完整，導致神經元死亡，MAP2是腦損傷的敏感標志[21]。MAP2 mRNA只存在于大腦灰質以及停止分化的遷移到大腦皮質區的神經元[22]。MAP2損失對神經元細胞產生嚴重的影響[19]。

髓鞘堿性蛋白（MBP）是中樞神經髓鞘膜的主要成分，MBP是少突膠質細胞和雪旺細胞合成的強堿性膜蛋白，在少突膠質細胞內以共價鍵結合于髓鞘質漿膜面，與細胞骨架、微管、微絲相連，維持中樞神經系統髓鞘結構和功能穩定，是急性腦損傷和脫髓鞘改變的特異性指標[23]。當腦損傷累及髓鞘時，MBP發生崩解，釋放入腦脊液，導致血液中MBP水平升高，引起神經功能障礙。MBP水平特異地反映髓鞘脫失、神經組織損傷程度[24]，作為判斷顱腦損傷病情嚴重程度和評估預后的指標[25]，MBP是中樞神經系統急性脫髓鞘的客觀生化指標[26]。

細胞信息交流（即細胞通訊）有長距通訊和短距通訊兩種方式，長距通訊以激素或生長因子為介質，通過血液循環和局部組織液的流動，將信息從一個細胞傳遞至另一個細胞；短距通訊在相鄰的細胞間形成直接通道，信息物質進行相互交流。BMSCs有免疫特性，不僅能夠逃避免疫識別，還有免疫抑制作用[27]，可用于異體移植。BMSCs分泌多種神經營養因子[28]，以旁分泌的方式促進內源性NSCs增殖、分化，促進軸突再生和再髓鞘化，促進神經損傷修復。本實驗建立培養上清可以相互交流，但BMSCs與NSCs互不接觸的共育體系呈左右兩室平行結構，能在倒置顯微鏡下觀察兩種細胞的情況，可同時收集兩室的BMSCs和NSCs進行定量指標的檢測。本研究將BMSCs和NSCs共培養，結果顯示BMSCs很快貼壁，約2d可見有神經細胞從神經球中呈放射狀伸出軸突，3d后在BMSCs表面的大部分神經球變成散在的單個細胞，向四周遷徙。CRD含藥血清提高了BMSCs促進 NSCs增殖和分化，其途徑可能是促進BMSCs分泌某些蛋白質，通過微孔濾膜彌散到隔膜的另一側，促進NSCs向神經元細胞或少突膠質細胞方向分化。

毛茛科植物大三葉升麻,具有“升清陽”的功效，升麻中所含的三萜皂苷升麻H-1（cimicifugoside H-1）可以抑制腦缺血時興奮性氨基酸（Glu、Asp）的過度釋放，并增加抑制性氨基酸（Gly、γ-GABA）的濃度，減少由于興奮性氨基酸造成的神經細胞損傷[7]。本研究結果顯示，CRD含藥血清中、高劑量組分別和對照組、RD 含藥血清組比較，NSE、GFAP、MAP-2、MBP雙陽性NSCs差異有統計學意義，表明CRD含藥血清促進NSCs分化成神經元和膠質細胞的比例增高，CRD含藥血清濃度的高低決定了NSCs向神經元和膠質細胞方向分化的轉歸。詳細機制有待于進一步研究。

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Effect of Rehmannia Decoction Contained Serum on NSCs of Rats in BMSCs and NSCs Co-culture System

WU Bowen1,WU Mishan1,2*，WANG Huina3,GUO Jindong1,GAO Weijuan1,2，WANG Ru1,HAN Hongwei1,SHI Xuliang1
（1.Hebei College of Chinese Medicine,Shijiazhuang,Hebei 050200,China;2.Hebei Key Laboratory of Chinese Medicine on Cardio-Cerebrovascular Disease,Shijiazhuang,Hebei 050091,China;3.Chengde Medical College,Chengde,Hebei 067000,China）

ObjectiveTo explore the effect of Cimicifuga heracleifolia Kom.as medicinal guiding of Rehmannia decoction(CRD)contained serum on survival and differentiation of neural stem cells (NSCs)in NSCs and bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)co-culture system.MethodsFirstly,the modeling of BMSCs co-cultured with NSCs was set up，then CRD contained serum was put into this co-culture syste.The cells of 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU)and neuron-specific enolase(NSE),glial fibrillary acidic protein(GFAP),microtubule-associated protein(MAP2)，myelin basic protein(MBP)were stained with double immunocytochemical staining method at 3rd dayof culture.The survival rate of NSCs was detected by the flow cytometry (FCM)and expression of NSCs was detected by immunocytochemistry and Western bolt.The effect of CRD contained serum on survival and differentiation of NSCs was analyzed.ResultsCompared with the normal saline group,higher concentration and middle concentration of CRD contained serum could significantly increased the survival rate of NSCs,and the NSE,GFAP,MAP-2and MBP activity on the 7th day in BMSCs and NSCs co-culture system(P＜0.01).ConclusionCRD contained serum could promote the effective differentiation and increase the survival rate activity of NSCs and in BMSCs and NSCs co-culture system.

bone marrow mesenchymal stem cells； neural stem cells； medicinal guiding； Rehmannia decoction； drug serum；neuron-like cells

本文引用：武博文，武密山，王慧娜，郭金棟，高維娟，王 茹，韓紅偉，師旭亮.地黃飲子含藥血清對大鼠BMSCs與NSCs共培養影響轉歸的研究[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（10）：1056-1062.

R285.5；R393

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.010.003

2017-2－23

國家自然科學基金資助項目（81073074，30472200）；河北省自然科學基金項目（H 2013206005）；河北省高等學校科學技術研究重點項目(ZD2015053)；河北省高等學校高層次人才科學研究項目（GCC2014013）。

武博文，女，學士，研究方向：心腦血管病的中醫藥治療。

* 武密山，男，博士，教授，博士研究生導師，E-mail:wumishan@hebcm.edu.cn。

（本文編輯 楊 瑛）