健脾補土組方對體外神經元低氧/復氧后PI3K、Akt、Caspase-3表達的影響

陳昱文 ，李 花 ，3*，劉旺華 ，3，周小青 ，3，鄭彩杏 ，金 夢 ，范元碩 ，李誠均 ，顏艷艷

（1.湖南中醫藥大學中醫診斷研究所，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學中醫診斷學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410007；3.湖南中醫藥大學數字中醫藥協同創新中心，湖南 長沙 410208）

健脾補土組方對體外神經元低氧/復氧后PI3K、Akt、Caspase-3表達的影響

陳昱文1，2，李 花1，2，3*，劉旺華1，2，3，周小青1，2，3，鄭彩杏1，2，金 夢1，2，范元碩1，2，李誠均1，2，顏艷艷1，2

（1.湖南中醫藥大學中醫診斷研究所，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學中醫診斷學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410007；3.湖南中醫藥大學數字中醫藥協同創新中心，湖南 長沙 410208）

目的觀察健脾補土組方對新生SD鼠神經元體外培養低氧/復氧后的凋亡情況以及PI3K、Akt、Caspase-3表達的影響，探討其減少神經元凋亡的作用機制。方法原代分離培養新生SD鼠神經元，隨機分為正常血清對照組、低氧模型組、神經生長因子組、健脾補土組。將標本低氧誘導24h，再復氧培養4h進行造模。用流式細胞術檢測神經元凋亡情況，RT-qPCR法檢測 PI3K、Akt、caspase-3mRNA的表達，免疫細胞化學法和Western blot法檢測PI3K、Akt、caspase-3蛋白的表達。結果與正常對照組相比，低氧模型組神經元凋亡率顯著增加，PI3K、Akt mRNA與蛋白表達顯著減少，Caspase-3mRNA與蛋白表達顯著增加；與低氧模型組比較，神經生長因子組、健脾補土組神經元凋亡率均顯著減少，PI3K、Akt mRNA及蛋白表達顯著增強，Caspase-3mRNA及蛋白表達顯著較少（P＜0.01）；與神經生長因子組比較，健脾補土組神經元凋亡率顯著減少，PI3K、Akt mRNA及蛋白表達顯著增加，Caspase-3mRNA及蛋白表達顯著降低。結論健脾補土組方能減少腦缺血后神經元的凋亡，其作用機制可能與其通過上調PI3K和Akt的表達水平，最終抑制在細胞凋亡中起關鍵作用的因子Caspase-3的表達有關。

健脾補土；神經元；凋亡；磷脂酰肌醇-3激酶；蛋白激酶-B；半胱天冬酶-3

缺血性腦卒中是嚴重危害當代人類健康的常見病與多發病之一，其發病后的高致殘率與腦缺血后發生神經細胞凋亡有緊密聯系[1]。對于腦缺血后半暗帶區的血供的及時恢復，阻止神經元進一步凋亡，最大程度上促進腦功能的恢復，是當前治療腦缺血疾病急需解決的問題。研究表明，在涉及細胞凋亡機制的眾多信號轉導通路中，磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）是其中最為重要的信號通路之一，可通過調控凋亡蛋白和凋亡基因來實現對細胞凋亡的抑制[2]，在細胞生長、增殖、分化過程中起到極其關鍵的作用。本課題組通過研究發現中醫“脾土”功能與細胞外基質的功能有諸多相似之處[3]，提出了以健脾補土法治療中風后遺癥的觀點，并通過前期研究發現健脾補土組方對腦缺血損傷患者的認知能力和智力狀態有顯著改善[4]，能通過抑制NF-κB炎性信號通路的激活而抗腦缺血/再灌注損傷減少神經元凋亡[5]，且能夠抑制MMP-2表達，保護血腦屏障[6]。本實驗在此基礎之上進一步探討健脾補土方抗腦缺血損傷、減少神經元凋亡的作用機制。本研究通過觀察新生SD鼠體外神經元經低氧/復氧損傷后健脾補土組方對其凋亡情況以及PI3K、Akt、Caspase-3表達變化的影響，探討健脾補土法抗腦缺血損傷作用及機制。

1 材料

1.1 實驗動物

用于神經元細胞原代培養用鼠選用20只1～3d出生的SPF級SD鼠，雌雄各半。另選用200～250g SPF級大鼠20只，用于含藥血清的制備，雌雄各半。老鼠均購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗單位使用許可證編號：SYXK（湘）2013-0005；許可證號：SCXK(湘)2011-0003。

1.2 實驗藥物

健脾補土組方以健脾益氣經典名方四君子湯為基礎加入黃芪、山藥、薏苡仁組成。處方組成：人參 15g，白術 12g，茯苓 10g，黃芪 15g，山藥 12g，薏苡仁12g，炙甘草6g。均購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院。

1.3 主要試劑與儀器

Neuralbasal培養基（Gibico公司）、木瓜蛋白酶（Sigma公司）、B27生長因子（Gibico 公司）、神經生長因子（NGF）（Peprotech 公司）、逆轉錄試劑盒、TRIZOL總RNA提取試劑、SYBGREEN PCR Mix、通用基因組DNA提取試劑盒 （康為世紀）、EDTA（Sigma公司）、DEPC、Tris（Sigma 公司）、引物（上海生工）、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基）、神經元特異性烯醇化酶抗體（NSE，型號：10149-1-AP）、DAB試劑盒 （中杉金橋）、TGL-16臺式冷凍離心機 （湘儀）、DYCZ-40A轉膜儀 （北京六一）、DH-160I直熱式二氧化碳培養箱 （上海三藤儀器）、7220-01熒光定量RCP儀 （Thermo公司）、MB-530酶標儀（匯松）、流式細胞儀（BD公司）、BA210T顯微鏡（Motic公司）。

2 方法

2.1 受試藥物制備

取健脾補土組方飲片加水適量，浸泡2h，用水煎煮。首煎用6倍水，水沸后文火煎煮1.5h；第二次用3倍水，水沸后文火煎煮1h。兩次水煎液混合，濃縮至濃度為1g/mL的生藥，放于4℃冰箱冷藏備用[7]。

2.2 含藥血清制備

SD大鼠適應性喂養3d后予以健脾補土組方藥液（1g/mL）灌胃，給藥量 14.8g/kg，2 次/d，連續給藥3d，并于末次灌胃后2h經腹主動脈采血，大鼠采血完后,將采血管置于離心機內以3 000r/min的速度離心15min。離心完畢后用移液槍將含藥血清混合后一起移入50mL離心管內,放在預熱好的水浴鍋內56℃水浴滅活30min,然后血清過0.2 μm一次性濾器過濾,用2mL凍存管分裝后用封口膠封口,標記好后凍存于-80℃冰箱備用[8]。

2.3 原代細胞培養

在超凈工作臺下分離新生SD鼠海馬組織，剪碎后將組織碎片裝入5mL小玻璃瓶中。向瓶中加入終濃度為5mL濃度為2mg/mL的木瓜蛋白酶，混勻，在37°C溫度下消化10min，每5min顛倒離心管1次。加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基終止消化，離心機1 000r/min離心10min，棄去上清液，重復離心1次。加入DMEM/F12培養液，用巴氏管輕輕吹打成細胞懸液，過200目濾網后種植于多聚賴氨酸（0.1mg/mL）包被的6孔培養板中，每孔2mL，接種密度為4×105cell/mL，于37°C培養箱中培養。第二天全部換成無血清培養液 （98%Neurobasal Media，2%B27 Supplement，0.5/上 Glutamine solution；1mMHepes），之后每 2～3 天半量換液 1 次[9]。

2.4 細胞化學染色鑒定

培養第10天后，取出細胞爬片用于免疫細胞化學鑒定：PBS液清洗爬片2×3次，將爬片用4%多聚甲醛固定30min，PBS液沖洗5min×3次，加入3%H2O2，室溫10min以滅活內源性酶，PBS液沖洗3min×3次；孵育一抗：滴加適當稀釋的一抗 （1∶100），4 ℃過夜，PBS 液沖洗 5min×3次；孵育二抗：滴加50～100 μL抗兔IgG抗體-HRP多聚體，37℃孵育 30min，PBS液沖洗 5min×3次；DAB顯色：滴加預制好的顯色劑DAB工作液50～100 μL，于室溫下孵育1～5min，在鏡下觀察控制反應時間，后用蒸餾水洗滌；蘇木素復染5～10min，蒸餾水沖洗，PBS液返藍；各級酒精 （60%～100%）脫水，每級5min。取出后置于二甲苯10min，2次，中性樹膠封片、顯微鏡觀察。

2.5 含藥血清的合理化濃度摸索

取新鮮的神經元細胞，將細胞濃度調為5×107/L接種于96孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM培養24h后，再用DMEM無血清培養基培養24h。然后將細胞分成各實驗組，各實驗組加入不同濃度含藥血清（1%、5%、10%、15%、20%），用含 10%胎牛血清的DMEM培養24h后，以MTT法測定A570 nm吸光度，測出不同含藥血清濃度對細胞增殖的抑制率，摸索出含藥血清的無毒性濃度。以對細胞生長抑制率＜20%的濃度作為無細胞毒性的濃度，最后確定以最大無毒性濃度（15%）作為實驗工作濃度[10]。

2.6 分組與造模

將培養好的神經元細胞分成四組：正常血清對照組（簡稱正常對照組）、正常血清+低氧(10%O2)（簡稱低氧模型組）、低氧+正常血清+神經生長因子（0.01mg/mL）（簡稱神經生長因子組）、低氧+健脾補土組方含藥血清組（簡稱健脾補土組）。將標本放入37℃三氣培養箱中，低氧誘導24h后，恢復正常條件培養4h。

2.7 指標檢測

2.7.1 流式細胞術檢測不同處理對細胞凋亡的影響按照AnnexinⅤ-FITC/PI雙標法，先用PBS液洗滌細胞后，用雙蒸水稀釋好的結合緩沖液重懸細胞，并調整細胞濃度為（2-5）×105/mL。再取 200 μL 細胞懸液，加入 5 μL Annexin V-FITC（20 μg/mL）混勻后，加入 5 μL Propidium Iodide，混勻，室溫、避光、反應 5～15min。最后再用 PBS液洗滌細胞，以190 μL稀釋的結合緩沖液重懸， 加 10 μL 20 μg/mLPI。用流式細胞儀檢測，激發波長Ex=488nm；發射波長 Em=530nm[11]。

2.7.2 RT-qPCR 法檢測 PI3K、Akt、Caspase-3mRNA的表達 按照TRIZOL總RNA提取試劑操作，提取神經元的總RNA，并于紫外分光光度計檢測其濃度，將總RNA經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見明顯的28s、18s兩條區帶，表明其完整性。在已調制好的 20mL反應液中加入2 μL的總RNA，混合均勻后進行反轉錄。應用SYBR法進行RT-qPCR檢測，利用Primer 5.0 設計引物，各自的引物依次為：PI3K-F：CACTGGTAGACGATGACGAGGAT，PI3K-R：TTGATGACGCAATGTTTGACTT，擴增長度 196bp；Akt-F：TACCTG AAGCTACTGGGCAAGGG，Akt-R：CGGTCGTGGG TCTGGAAT GAG，擴增長度212bp；Caspase3-F:GGAAC GAACGGACCTGTG，Caspase3-R：GGGTGCGGTAGAG TAAGCA，擴增長度 219bp。采用 2-ΔΔCt法，以 2-ΔΔCt值反映目的基因表達水平，其數值越大，表達越強[12]。

2.7.3 免疫細胞化學法和Western blot法檢測PI3K、Akt、Caspase-3蛋白的表達 取出細胞爬片，PBS清洗2-3次，將爬片用4%多聚甲醛固定30min，PBS沖洗5min×3次，加入3%H2O2，室溫10min以滅活內源性酶。PBS沖洗3min×3次；加入適量按1∶200稀釋的一抗，放入4℃冰箱中過夜。取出標本，用PBS緩沖液沖洗3min×3次。加入山羊抗兔 IgG(二抗），室溫下孵育15min。無菌PBS緩沖液沖洗后進行DAB顯色約10min。蘇木素復染5～10min，蒸餾水沖洗，無菌PBS緩沖液返藍。各級酒精 （60%～100%）脫水，每級5min。取出后置于二甲苯10min，2次。加入適量樹脂膠進行封片，鏡檢[13]。每組每個爬片選取5個400倍視野進行拍照。應用Image-Pro Plus 6.0軟件選取相同的棕黃色細胞作為判斷所有照片陽性細胞的共同參照標準，然后對每張照片進行分析，計算出每張照片陽性細胞的積分光密度值（integrated optical density，IOD）。

Western blot法經蛋白質抽提劑提取神經元蛋白，行SDS-PAGE電泳后進行轉膜，將膜浸入用TBST配制好的5%脫脂奶粉后，放置于室溫下1h。將一抗用封閉液稀釋（1∶200），將膜與一抗一起孵育，在4℃下過夜。孵育結束后，用TBS-T清洗3次，每次15min。用封閉液稀釋HRP標記的二抗（稀釋比例1∶4 000），將稀釋后的二抗與膜共同孵育 45～60min。孵育結束后，TBS-T清洗15min×3次。使用ECL化學發光液將膜孵育3min，用保鮮膜將膜包裹雜交膜，在暗盒內與X膠片曝光數秒至數分鐘，顯影沖洗。最后用 AlphaEase FC軟件分析自身灰度值，以目的蛋白條帶灰度與管家蛋白β-actin條帶灰度的比值表示蛋白表達水平。

2.8 統計學處理

3 結果

3.1 免疫細胞化學法細胞鑒定結果

NES免疫細胞化學法染色（DAB染色），胞漿和突起被染成棕褐色而胞核為藍色的為陽性細胞，整個細胞不被染色的為陰性細胞，在高倍鏡下隨機選取5個視野中陽性神經元的數目占總細胞的比例為神經元純度，經鑒定神經元純度達96%左右。見圖1。

圖1 神經細胞鑒定光鏡圖（免疫組化，×400）

3.2 健脾補土組方對神經元凋亡的影響

AnnexinⅤ/PI流式細胞分析檢測，與正常對照組相比，低氧模型組神經元凋亡率顯著增加，差異有統計學意義(P＜0.01)；與低氧模型組比較，神經生長因子組、健脾補土組神經元凋亡率均顯著減少，差異有統計學意義(P＜0.01)；與神經生長因子組比較，健脾補土組神經元凋亡率顯著減少，差異有統計學意義(P＜0.01)。見表1。

表1 各組神經元細胞凋亡比較 （±s，%）

表1 各組神經元細胞凋亡比較 （±s，%）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與低氧模型組比較，△△P＜0.01；與神經生長因子組比較，＃＃P＜0.01。

組別正常對照組低氧模型組神經生長因子組（0.01mg/mL）健脾補土組（1g/mL）凋亡率6.23±0.63 53.22±4.32**31.35±2.33**△△13.22±1.95**△△＃＃F 值 29.87n 5 5 5 5

3.3 健脾補土組方對神經元細胞 PI3K、Akt、Caspase-3mRNA表達的影響

RT-qPCR檢測結果顯示，與正常對照組比較，低氧模型組PI3K、Akt mRNA表達顯著減少，Caspase-3mRNA表達顯著增加，差異均有統計學意義（P＜0.01）。與低氧模型組比較，神經生長因子組與健脾補土組PI3K、Akt mRNA表達均顯著增加，Caspase-3mRNA表達顯著減少，差異均有統計學意義（P＜0.01）。與神經生長因子組比較，健脾補土組PI3K、Akt mRNA表達均顯著增高，Caspase-3mRNA表達顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 各組神經元PI3K、Akt、Caspase-3mRNA的表達比較（±s，2-△△ct值，n=5）

表2 各組神經元PI3K、Akt、Caspase-3mRNA的表達比較（±s，2-△△ct值，n=5）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與低氧模型組比較，△△P＜0.01；與神經生長因子組比較，＃＃P＜0.01。

組別正常對照組低氧模型組神經生長因子組健脾補土組Caspase3 1.000±0.000 43.3506±2.2425**16.2844±1.0741**△△3.9382±0.1657**△△＃＃F 值 33.72 38.67 35.64 PI3K 1.000±0.000 0.0251±0.0014**0.0776±0.0084**△△0.5917±0.0456**△△＃＃Akt 1.000±0.000 0.0241±0.0011**0.1037±0.0044**△△0.6579±0.0482**△△＃＃

3.4 健脾補土組方對神經元細胞 PI3K、Akt、Caspase-3蛋白表達的影響

免疫細胞化學法顯示，正常血清對照組中神經元細胞核完整，細胞突起明顯，未見明顯細胞漿黃染。低氧模型組中神經元細胞核皺縮、突起回縮，細胞漿黃染較多。PI3K與Akt蛋白陽性表達在對照組中顯示數目最多，在健脾補土組與神經生長因子組中表達逐漸較少，在低氧模型組中表達數目最少；Caspase-3、Caspase-8蛋白陽性表達在低氧模型組中顯示數目最多，在神經生長因子組與健脾補土組中表達數目逐漸減少，在對照組中已基本未見陽性表達（見圖2-4）。統計分析結果：與正常血清對照組比較，低氧模型組神經元PI3K、Akt蛋白表達顯著減少，Caspase-3蛋白表達顯著增加，差異均有統計學意義（P＜0.01）；與低氧模型組比較，神經生長因子組和健脾補土組神經元PI3K、Akt蛋白表達顯著增加，Caspase-3蛋白表達顯著較少，差異均有統計學意義（P＜0.01）；與健脾補土組比較，神經生長因子組神經元PI3K、Akt蛋白表達均顯著減少，差異有統計學意義 （P＜0.01），Caspase-3 蛋白表達明顯增加，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表3。

表3 各組神經元PI3K、Akt、Caspase-3蛋白表達比較（±s，IOD 值，n=5）

表3 各組神經元PI3K、Akt、Caspase-3蛋白表達比較（±s，IOD 值，n=5）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與低氧模型組比較，△△P＜0.01；與神經生長因子組比較，＃P＜0.01，＃＃P＜0.05。

組別正常對照組低氧模型組神經生長因子組健脾補土組Caspase-3 0.0062±0.0009 0.0684±0.0040**0.0301±0.0012**△△0.0286±0.0011**△△＃F 值 26.72 30.67 28.64 PI3K 0.0733±0.0035 0.0302±0.0015**0.0473±0.0022**△△0.0627±0.0052**△△＃＃Akt 0.1280±0.0088 0.0344±0.0018**0.0540±0.0026**△△0.0742±0.0052**△△＃＃

圖2 各組中神經元PI3K蛋白表達（免疫細胞化學法，×400）

圖3 各組中神經元Akt蛋白表達的比較（免疫細胞化學法，×400）

圖4 各組中神經元Caspase-3蛋白表達的比較（免疫細胞化學法，×400）

Western Blot法檢測結果顯示：與正常對照組比較，低氧模型組神經元PI3K、Akt蛋白表達顯著減少，Caspase-3蛋白表達顯著增加，差異均有統計學意義（P＜0.01）；與低氧模型組比較，神經生長因子組和健脾補土組神經元PI3K、Akt蛋白表達顯著增加，Caspase-3蛋白表達顯著較少，差異均有統計學意義（P＜0.01）；與神經生長因子組比較，健脾補土組神經元PI3K、Akt蛋白表達均顯著增加，Caspase-3蛋白表達顯著減少，差異有統計學意義(P＜0.01)。見表4、圖5。

表4 各組神經元 PI3K、Akt、Caspase-3 蛋白表達比較 （±s，n=5）

表4 各組神經元 PI3K、Akt、Caspase-3 蛋白表達比較 （±s，n=5）

注：與正常対照組比較，**P＜0.01；與低氧模型組比較，△△P＜0.01；與神經生長因子組比較，＃＃P＜0.01。

組別正常對照組低氧模型組神經生長因子組健脾補土組Caspase-3/β-actin 0.076±0.008 0.518±0.033**0.372±0.025**△△0.178±0.011**△△＃＃F 值 43.29 38.56 45.37 PI3K/β-actin 0.671±0.033 0.221±0.013**0.324±0.023**△△0.424±0.035**△△＃＃Akt/β-actin 0.861±0.053 0.208±0.022**0.368±0.021**△△0.535±0.035**△△＃＃

圖5 各組神經元PI3K、Akt、Caspase-3蛋白表達電泳圖

4 討論

腦缺血再灌注導致腦損傷后，缺血中心區神經元以壞死為主，半暗帶區神經元則以凋亡為主。所以抑制半暗帶區神經元凋亡在改善缺血再灌注損傷中起到了重要作用[14]。腦缺血再灌注的損傷所涉及的作用機制較為復雜，而凋亡細胞內基因的表達對神經元凋亡具有更直接、更重要的作用[15]。腦缺血再灌注損傷后，可通過多條相應的信號轉導通路而導致細胞凋亡?，F代研究認為，PI3-K/Akt通路是重要的細胞存活信號通路之一，可通過對其信號通路的激活從而抑制神經細胞的凋亡，最終發揮對腦的保護作用[16-17]。

PI3K/Akt信號通路存在于大多數細胞之中，對于細胞的增殖、遷移、分化以及凋亡起到了重要的調節作用[18]。P13K是由調節亞基p85和催化亞基p110所組成的異二聚體，其主要功能是激活Akt。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在靜息狀態下，Akt位于細胞質內，由Aktl、Akt2和Akt3三個異構體組成。Akt是非常重要的抗凋亡調節因子，能介導多種生物學效應。Akt的活化需要Serl24、Thr450、Thr308和Ser473等4個位點的磷酸化。研究發現PI3-K有多種下游效應分子，而Akt為PI3-K直接的下游作用靶點，PI3-K被激活后進一步激活Akt及其下游的信號的級聯反應，參與細胞的生長、分化和存活[19]。PI3K的激活方式有兩種，一種是與具有磷酸化酪氨酸殘基的生長因子受體或連接蛋白相互作用，使二聚體構象發生改變從而被激活；另一種是通過Ras和p110直接結合致使PI3K發生活化?；罨腜I3K產生第二信使3,4,5-三磷酸磷脂肌醇PIP3，PIP3與信號蛋白Akt和磷酸肌醇依賴激酶(PDK1)結合，從而使Akt的蛋白結構發生改變，致使細胞膜上的PDK-1和PDK-2從而發生蛋白磷酸化，最終導致Akt的活化?；罨腁kt可通過磷酸化從而激活或抑制其下游的作用底物如 Caspase-9、Bad、NF-κB、mTOR等改變，從而對細胞的增殖、分化、凋亡以及遷移進行調節。Caspase-3是參與細胞凋亡的核心環節，是Akt下游線粒體凋亡信號通路的重要組成部分，在細胞凋亡過程中，由于凋亡啟動蛋白信號的作用，Caspase-8，Caspase-9等啟動型基因被激活，然后通過級聯作用最終激活執行型因子Caspase-3。Caspase-3被激活后可裂解其底物蛋白激酶C，使損傷的DNA無法進行修復。此外，活化的Caspase-3還可直接誘導線粒體凋亡途徑，加速線粒體功能障礙和細胞色素C釋放，最終引起細胞凋亡[20]。研究表明[21]，在腦缺血再灌注期Caspase-3的表達早于細胞凋亡，且表達持續時間長，是檢測缺血再灌注凋亡的敏感指標。Jover-Mengual等研究發現，全腦缺血后立即注射外源性雌激素，可以通過激活PI3K/Akt通路，從而抑制Caspase-3的活性，發揮抗細胞凋亡作用，改善缺血敏感區海馬CA1區神經元損害情況[22]。

腦缺血卒中屬中醫學“中風”范疇，目前普遍認為中風的病位在心腦，病因病機多是在內傷積損的前提下，又因感受外邪、勞損過度、飲食失節或情志不遂等觸發，而令腦脈痹阻或血溢腦脈之外所致。中風發生后患者多存在氣血虧虛，然脾為人體后天之本，氣血生化之源，因此脾胃與中風有著密切聯系。而綜觀歷代有關中風病的文獻記載，多重視對肝腎的論述，而忽略了脾胃。健脾補土組方擬用四君子湯為基本方，方中人參、白術、茯苓、甘草四藥配伍，共奏益氣健脾之效。由于脾失健運，往往多生痰濕，且現代人多喜食肥甘厚味，臨床上常見脾虛生濕的證候，故另加入黃芪、山藥與薏苡仁三藥共用以增強補氣祛濕之功?，F代藥理學證明，方中人參[23]、白術[24]、黃芪[25]、薏苡仁[26]及其提取物等均能減少神經細胞的凋亡，改善腦缺血損傷。

本研究通過對體外神經元進行低氧/復氧損傷造模，模擬腦缺血再灌注損傷模型，借此觀察健脾補土組方對其神經元凋亡情況以及PI3K、Akt、Caspase-3mRNA及蛋白表達的影響。結果顯示，與正常血清對照組比較，低氧模型組神經元凋亡率顯著增加，PI3K、Akt mRNA及蛋白表達顯著減少，Caspase-3mRNA及蛋白表達顯著增加，提示當神經元遭受缺氧損傷時，PI3K、Akt的表達被抑制，而Caspase-3的表達增強。與低氧模型組比較，健脾補土組神經元凋亡率顯著降低，PI3K、Akt mRNA及蛋白表達顯著增加，二者分子水平及其趨勢基本一致，Caspase-3mRNA及蛋白表達顯著較少，提示健脾補土組方能在一定程度上抑制神經元的凋亡從而改善腦缺血損傷，其作用可能與通過上調PI3K和Akt的表達，最終抑制其下游對細胞凋亡起關鍵作用的基因Caspase-3的表達有關；進一步驗證了神經細胞的凋亡與PI3K、Akt的表達呈負相關，與Caspase-3的表達呈正相關,與前人研究結論一致。本實驗中健脾補土組表達顯著優于神經生長因子組，可能與中藥復方中多種藥物活性成分作用的疊加或協同，并且可通過多途徑、多靶點干預腦缺血發生機制有關。因本實驗為體外水平研究，干擾條件較少，而健脾補土組方能否通過血腦屏障等其它體內干擾因素，同樣影響此信號通路及相關因子的表達，有待進一步進行體內水平的研究。此外，引起腦缺血后神經元細胞凋亡發生的是一個多條信號通路串聯交叉形成的復雜信號網絡，健脾補土組方對其他相關通路的影響也尚待深入研究。

綜上所述，健脾補土組方能減少腦缺血后神經元的凋亡，其作用機制可能與其通過激活PI3K/Akt通路，從而上調PI3K和Akt的表達，最終抑制在細胞凋亡中起關鍵執行作用的因子Caspase-3的表達有關。

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Effect of Jianpi Butu Formula on the Expression of PI3K,Akt,Caspase 3and Apoptosis in Neurons in Vitro Induced by Hypoxia/Reoxygenation

CHEN Yuwen1,2,LI Hua1,2,3*,LIU Wanghua1,2,3，ZHOU Xiaoqing1,2,3，ZHENG Caixing1,2，JIN Meng1,2，FAN Yuanshuo1,2，LI Chengjun1,2，YAN Yanyan1,2
(1.Institute of Diagnostics Traditional Chinese Medicine,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.The Key Laboratory of Diagnostics of Chinese Medicine in Hunan Province,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China;3.Collaborative Center for Research and Innovation of Digital Chinese Medicine,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo observe the effect of Jianpi Butu (tonifying spleen)formula on apoptosis and expression of PI3K,Akt and Caspase3 in neonatal SD neurons cultured in vitro induced by hypoxia/reoxygenation，to explore the mechanism of reducing neuronal apoptosis.MethodsPrimary cultured neurons of newborn SD rats were randomly divided into normal serum control group,hypoxia model group,NGF group,Jianpi Butu formula group.Specimens to modeling were induced by hypoxia for Mei,reoxygenation for 4h.The neuronal apoptosis was induced by flow cytometry.The expression of PI3K,Akt and Caspase3 mRNA was determined by qPCR.The expression of PI3K,Akt and Caspase3 protein was detected by immunocytochemistry and Western blot.ResultsCompared with normalcontrolgroup,the rate ofneuronalapoptosis in hypoxia model group increased significantly,the expression of Akt mRNA and protein reduced obviously,and the expression of Caspase3 protein and mRNA increased significantly.Compared with the hypoxia model group,the rate of neuronal apoptosis in NGF group,Jianpi Butu formula group decreased significantly,and the expression of Akt mRNA and protein increased obviously,and the expression of Caspase3 mRNA and protein decreased significantly (P ＜0.01).Compared with the nerve growth factor group,the neuronal apoptosis rate in Jianpi Butu group decreased significantly,the expression of Akt mRNA and protein increased obviously,and the expression of Caspase3 mRNA and protein decreased significantly.ConclusionJianpi Butu formula could reduce the apoptosis of neuron after cerebral ischemia.Its mechanism may be related to the up-regulated expression of PI3K and Akt,the ultimate expression of inhibitory factor Caspase3 plays a key role in cell apoptosis.

tonifying spleen;neurons;apoptosis;PI3K;FAK;Caspase3

本文引用：陳昱文，李 花，劉旺華，周小青，鄭彩杏，金 夢，范元碩，李誠均，顏艷艷.健脾補土組方對體外神經元低氧/復氧后PI3K、Akt、Caspase-3表達的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（10）：1063-1069.

R285.5；R743

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2017.010.004

2016-12-25

國家自然科學基金(81202632、81373702、81473567)，教育部博士點基金(20124323120003)，湖南省自然科學基金(13JJ3097)，湖南省教育廳科研項目(14B134)，湖南省高校創新平臺開放基金（15K092），湖南中醫藥大學中診開放基金(2015ZYZD30)，湖南省研究生科研創新項目（CX2016B368）。

陳昱文，在讀碩士研究生，研究方向：中醫心腦血管病證治研究。

*李 花，女，副教授，E-mail:1041584415@qq.com。

（本文編輯 楊 瑛）