丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合骨髓干細胞動員對心肌缺血再灌注損傷大鼠內(nèi)皮的保護作用

李鑫輝，黃淼鑫，杜建芳，黃政德,許福麗，肖 青，郭晨鶴，李彩云

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208）

丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合骨髓干細胞動員對心肌缺血再灌注損傷大鼠內(nèi)皮的保護作用

李鑫輝，黃淼鑫，杜建芳，黃政德,許福麗，肖 青，郭晨鶴，李彩云

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208）

目的通過觀察心肌缺血再灌注損傷大鼠NO水平、eNOS蛋白和eNOS mRNA表達，探討丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合骨髓干細胞動員對心肌缺血再灌注損傷大鼠內(nèi)皮保護作用。方法大鼠60只，隨機分為假手術(shù)組、模型組、重組人紅細胞生成素（recombinant human erthropoietin，rhEPO）動員組、丹參通絡(luò)解毒湯組；丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合動員組，每組12只。于造模后14d采用放射免疫法測定NO水平、免疫組化法測定eNOS蛋白和采用實時熒光定量PCR法測定eNOS mRNA表達。結(jié)果與假手術(shù)組比較，各組NO水平，eNOS蛋白和eNOS mRNA表達均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，rhEPO動員組、丹參通絡(luò)解毒湯組和丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合動員組NO水平升高，eNOS蛋白和eNOS mRNA表達明顯提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與rhEPO動員組和丹參通絡(luò)解毒湯組比較，丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合動員組NO水平顯著升高，eNOS蛋白和eNOS mRNA表達明顯提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論丹參通絡(luò)解毒湯可以提高缺血心肌eNOS mRNA表達，進一步促進eNOS蛋白表達，升高NO水平，是該方保護心肌缺血再灌注損傷大鼠內(nèi)皮重要機制之一，同時該方聯(lián)合動員劑對內(nèi)皮保護有增強促進作用。

eNOS；心肌缺血再灌注損傷；骨髓干細胞；丹參通絡(luò)解毒湯

缺血性心臟病是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見疾病，其最有效的治療措施是恢復(fù)血液供應(yīng)，但心肌恢復(fù)血流再灌時又可以使缺血心肌損傷加重，即心肌缺血再灌注損傷 (ischermic reperfusion injury,IRI)。近年來，干細胞治療心肌IRI是近年臨床和科研的研究熱點，有研究證明IRI后人體能動員自身骨髓干細胞，并遷移到缺血部位，在心臟微環(huán)境的影響下，分化為心肌細胞、血管內(nèi)皮細胞等，進而促進心肌組織修復(fù)[1]。然而，遷移到缺血部位的干細胞數(shù)量極少[2]，不能很好的恢復(fù)心臟功能。因此，采用骨髓干細胞動員劑可以很好的提高外周血液中干細胞數(shù)量，從而促進心肌組織的修復(fù)[3]。有研究表明中藥對干細胞的動員、歸巢、增殖和分化有優(yōu)勢互補、協(xié)同增效的作用[4]。本文探討丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合骨髓干細胞動員對心肌缺血再灌注損傷大鼠內(nèi)皮保護作用的分子機制，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SD大鼠60只，體質(zhì)量200～250g。由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。動物許可證號SCXK（湘）2009-0001。

1.2 主要試劑及藥品

Trizol試劑盒（批號：16495023）；AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶（批號：16374121）；RNA 酶抑制劑 （批號：163255012）；RNasin，Taq 酶（批號：16443013）；以上皆來源于美國Invitrogen公司。PCR 引物(批號：SH16385401，上海Invitrogen 公司)；rhEPO（批號：JT196236，華北制藥集團金坦生物技術(shù)公司）；eNOS一抗、即用型SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；羊抗兔 HRP標(biāo)記二抗(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

丹參通絡(luò)解毒湯藥（丹參15g，玄參15g，當(dāng)歸10g，川芎 10g，紅花 10g，檀香 10g，黃連 6g，梔子 15g，生地黃 15g，麥冬 12g，銀花 10g，連翹10g，黃芪30g，水蛭6g等），由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房提供。浸泡，煎煮，去渣，水煎濃縮至藥液濃度2g/mL（含生藥），保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要儀器

Motic B5型顯微攝像系統(tǒng)，麥克奧迪實業(yè)集團公司；FTI2500 型凝膠成像儀，Pharmacia Biotech；UV-1700PharmaSpec型島津分光光度計，Japan；UNOⅡ型PCR儀，Germany Biometra公司；sequoia512型超聲心動圖儀，美國siemens公司。

2 實驗方法

2.1 造模方法

大鼠用10%水合氯醛以0.3mL/100g比例腹腔麻醉后，記錄標(biāo)準(zhǔn)II導(dǎo)聯(lián)心電圖。連接動物呼吸機，開胸暴露心臟，在左心耳和肺動脈圓錐間找到與左冠狀動脈伴行的冠狀靜脈,使之清楚暴露,并以此靜脈為標(biāo)志進行結(jié)扎。以心電圖QRS波群增高增寬，ST段抬高，心肌顏色發(fā)紺,為結(jié)扎成功。以ST段下降1/2,缺血部位心肌顏色恢復(fù)為血流再灌注成功[5]。

2.2 動物分組

大鼠60只，隨機分為假手術(shù)組、模型組、rhEPO動員組、丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合動員組。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎冠狀動脈,其余4組行IRI造模，開胸結(jié)扎冠脈30min,恢復(fù)冠脈血流；rhEPO動員組、丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合動員組在腹腔注射 rhEPO（2 000U/kg），每天 1 次，連續(xù) 5d（即造模前1天、造模當(dāng)天、造模后3天）,假手術(shù)組、模型組和丹參通絡(luò)解毒湯組腹腔注射同容量生理鹽水。

2.3 給藥劑量及方法

給藥劑量按人（60kg）與動物體表面積換算，丹參通絡(luò)解毒湯組和丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合動員組灌胃丹參通絡(luò)解毒湯藥7.8mL/(kg·d)[相當(dāng)于生藥含量15.65g/(kg·d)]5d（即造模前 2d、造模后 3d），每天1次；假手術(shù)組、模型組和rhEPO動員組灌胃等量生理鹽水5d，每天1次。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 血清NO檢測 實驗結(jié)束后，從實驗大鼠腹腔主動脈抽取血液樣本存放于離心管中，將離心機設(shè)置為2 000r/min離心10min，取其上清液，于-80℃冰箱儲藏備用。采用放射免疫法測定，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明步驟檢測血清中NO的含量，并記錄下來。

2.4.2 心肌細胞eNOS蛋白表達測定 取各組缺血心肌組織經(jīng)過4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋制作免疫組化病理切片（4 μm厚切片）。蛋白表達用免疫組化法檢測，按試劑盒使用說明書進行切片脫蠟、滅活內(nèi)源性酶、熱修復(fù)抗原、加一抗（1∶100）孵育；加羊抗兔 HRP 標(biāo)記二抗(1∶15 000)孵育、滴加試劑SABC孵育、顯色等操作。以細胞漿呈棕褐色為提高eNOS蛋白陽性表達。用圖像分析技術(shù)對陽性表達區(qū)域進行半定量分析，每張切片在顯微鏡400倍下隨機取5個視野，用彩色病理圖像分析系統(tǒng)測量平均灰度。

2.4.3 心肌細胞eNOS mRNA測定 采用實時熒光定量PCR法測定eNOS mRNA的含量，以GAPDH為內(nèi)參，引物見表1。取心肌組織提取RNA，RNA抽提按照試劑盒說明進行，測純度 OD260/280 在 1.8～2.0之間良好，說明RNA的完整性好，滿足實時熒光定量PCR法分析的要求。具體操作嚴(yán)格按照按照試劑盒說明書將反應(yīng)設(shè)為50 μL體系，94℃變性4min，40個循環(huán)擴增（94℃ 40s,57℃ 40s,72℃ 45s)。取10 μL PCR產(chǎn)物按組排列電泳1%瓊脂糖凝膠100V電泳1h，凝膠放置于凝膠成像檢測儀上觀察、照相，記錄實驗結(jié)果。以目的條帶與GAPDH基因條帶的光密度比值作為目的基因mRNA的表達量。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。數(shù)據(jù)計量資料以“±s”表示，計數(shù)資料用例數(shù)表示，資料比較先對數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，方差齊采用方差分析，方差不齊采用非參數(shù)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 PCR引物及擴增情況

3 結(jié)果

3.1 丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合骨髓干細胞動員對心肌IRI鼠血清NO水平的影響

結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組、rhEPO動員組、丹參通絡(luò)解毒湯組和丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合動員組NO 水平均明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，rhEPO動員組、丹參通絡(luò)解毒湯組和丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合動員組 NO 水平明顯升高 （P＜0.01）；rhEPO動員組與丹參通絡(luò)解毒湯組比較，NO水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；與 rhEPO 動員組、丹參通絡(luò)解毒湯組比較,丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合動員組NO水平明顯升高（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠血清NO水平的比較 (±s)

注：與假手術(shù)組比較：△△P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01；與 rhEPO動員組比較：▲▲P＜0.01；與丹參通絡(luò)解毒湯組比較：＃＃P＜0.01。

3.2 丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合動員骨髓干細胞對心肌IRI鼠心肌細胞eNOS蛋白表達的影響

結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組、rhEPO動員組、丹參通絡(luò)解毒湯組和丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合動員組eNOS 蛋白表達明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，rhEPO動員組、丹參通絡(luò)解毒湯組和丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合動員組eNOS 蛋白和表達明顯升高（P＜0.01）；rhEPO動員組與丹參通絡(luò)解毒湯組比較，eNOS蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與 rhEPO 動員組、丹參通絡(luò)解毒湯組比較,丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合動員組 eNOS 蛋白表達明顯升高(P＜0.01)，詳見表3,圖1。

3.3 丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合動員骨髓干細胞對IRI鼠心肌細胞eNOSmRNA表達的影響

結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組、rhEPO動員組、丹參通絡(luò)解毒湯組和丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合動員組 eNOSmRNA 表達明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，rhEPO動員組、丹參通絡(luò)解毒湯組和丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合動員組eNOSmRNA表達明顯升高（P＜0.01）；rhEPO 動員組與丹參通絡(luò)解毒湯組比較，e NOSmRNA 表達 差 異 無 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義 （P＞0.05）；與rhEPO動員組、丹參通絡(luò)解毒湯組比較,丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合動員組eNOSmRNA表達明顯升高 （P＜0.01）。見表3，圖2-3。

表3 對心肌IRI鼠心肌細胞eNOS蛋白和eNOSmRNA表達的影響 (±s)

表3 對心肌IRI鼠心肌細胞eNOS蛋白和eNOSmRNA表達的影響 (±s)

注：與假手術(shù)組比較：△△P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01；與 rhEPO動員組比較： ▲▲P＜0.01；與丹參通絡(luò)解毒湯組比較：＃＃ P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組rhEPO動員組丹參通絡(luò)解毒湯組丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合動員組n 12 12 12 12 12eNOS蛋白表達131.9±12.69 95.59±11.08△△120.8±9.60△△**115.7±7.54△△**122.1±6.72△△**▲▲＃＃eNOSmRNA 1.285±0.053 0.689±0.017△△0.801±0.018△△**0.781±0.027△△**0.972±0.141△△**▲▲＃＃F P 12.34 0.000 731.6 0.000

圖1 eNOS蛋白表達光鏡圖（免疫組化，×400）

圖2 eNOS基因PCR擴增結(jié)果電泳圖

圖3 GAPDH基因PCR擴增結(jié)果電泳圖

4 討論

骨髓釋放其干細胞到外周血的現(xiàn)象稱為骨髓干細胞動員。骨髓干細胞可以分化為多種組織細胞，當(dāng)心肌細胞損傷壞死引起一系列信號分子的釋放，骨髓干細胞可被“征募”到循環(huán)中參與遠處多種組織的修復(fù)和再生，但這種內(nèi)源性動員作用較弱，可以應(yīng)用動員劑將更多的骨髓干細胞“驅(qū)趕”入血，使外周血干細胞數(shù)量增加，并“歸巢”于損傷的心肌組織，在特定地組織微環(huán)境作用下“分化”為心肌細胞，縮小心肌梗死面積，抑制心室重構(gòu)的發(fā)展，保護內(nèi)皮細胞，從而改善心臟功能[6]。Rota等[7]人研究表明發(fā)生梗死的心臟進行骨髓干細胞移植后，移植的干細胞不僅分化出肌細胞，而且局部移植的骨髓干細胞能夠產(chǎn)生包括有心肌細胞和冠脈血管的新生心肌。骨髓干細胞中包含有內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，缺血性損傷及干細胞動員劑能動員EPCs到外周血液中，并歸巢到缺血組織，分化成內(nèi)皮細胞，形成新血管。促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)具有抗凋亡、抗炎，促進微血管生成等作用[8]。有研究表明EPO可以誘導(dǎo)血管生成和抑制細胞凋亡[9]，并在動物模型體內(nèi)顯著增強血管內(nèi)皮祖細胞的動員作用，進而定向分化為成熟的內(nèi)皮細胞，參與血管新生。在冠心病的發(fā)病中起主要作用的是內(nèi)皮型一氧化氮合酶 (endothelial nitric oxide synthase，eNOS)，它主要分布于內(nèi)皮細胞和心肌細胞中，而干細胞通過旁分泌作用產(chǎn)生有益的細胞因子VEGF通過產(chǎn)生鈣離子流的聚集作用下的NOS磷酸化來激活eNOS，eNOS通過催化L-精氨酸生成NO[10]，保護內(nèi)皮細胞，促進血管新生。本實驗研究結(jié)果顯示，與模型組比較,分別注射干細胞動員劑 rhEPO和給予丹參通絡(luò)解毒湯中藥治療后，大鼠心肌細胞eNOS mRNA表達和eNOS蛋白表達升高，NO水平升高，兩者比較無統(tǒng)計學(xué)差異，說明動員劑 rhEPO和丹參通絡(luò)解毒湯均可以保護內(nèi)皮，且保護效果相當(dāng)。同時，動員出來的骨髓干細胞又可以與宿主相互作用而分泌一些細胞因子或神經(jīng)遞質(zhì)來促進心功能的恢復(fù)。骨髓干細胞能夠不斷分泌腦衍化神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子以及轉(zhuǎn)化生長因子等對缺血后的組織起到保護作用。本實驗研究結(jié)果我們還發(fā)現(xiàn)丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合動員劑rhEPO使用時，保護內(nèi)皮效果更強，兩者具有相互增強促進作用。因此，我們推測丹參通絡(luò)解毒湯提高缺血心肌eNOS mRNA表達，進一步促進eNOS蛋白表達，升高NO水平，是該方保護血管內(nèi)皮重要機制之一，而該方與動員劑相互增強促進作用可能是該方通過改善EPCs遷移、增殖、分化的微環(huán)境，增加EPCs的動員量和歸巢量，通過細胞的旁分泌作用，促使EPCs分泌一些有益細胞因子，進而保護內(nèi)皮。

中醫(yī)學(xué)認為，心肌IRI是冠心病的一個病理過程，屬于“胸痹心痛”“真心痛”等范疇，其病位在心，涉及血脈，外邪和內(nèi)邪在機體中積聚日久逐漸蘊積成毒，毒損心絡(luò)，導(dǎo)致心絡(luò)不通,即使心肌再灌注治療血液再通，但缺血心肌組織原有代謝毒物未能排出，對心體的損害進一步加重，如此惡性循環(huán)。丹參通絡(luò)解毒湯是《溫病條辨》清營湯和《時方歌括》丹參飲基礎(chǔ)上，結(jié)合葉天士絡(luò)病理論及臨床實踐化裁而來，方中丹參活血化瘀、清心止痛，玄參清營養(yǎng)陰瀉火解毒，二者共為君藥；臣藥有當(dāng)歸、川芎、紅花、檀香行氣活血，通絡(luò)止痛。黃連、梔子、生地黃、麥冬養(yǎng)陰清營，瀉火解毒；佐使藥有銀花、連翹增強清熱解毒。又由于冠心病病程反復(fù)發(fā)作，邪據(jù)日久，耗氣傷正，方中加黃芪益氣扶正，以增加益氣活血功效。加水蛭增強活血通絡(luò)作用，藉其“蠕動之物可以松透病根”而直入絡(luò)分搜剔血絡(luò)。全方具有活血通絡(luò)，清營解毒，兼益氣養(yǎng)陰的功效，臨床治療冠心病療效顯著。鞠建慶等[11]根據(jù)相關(guān)統(tǒng)計分析，清熱解毒方藥治療不穩(wěn)定性心絞痛安全可靠，其“熱毒傷絡(luò)”的病機假說具有科學(xué)性。郭剛[12]認為“虛—瘀—毒”是冠心病發(fā)病基礎(chǔ)，而采用活血化瘀解毒中藥復(fù)方治療冠心病不穩(wěn)定性心絞痛的臨床效果顯著。

綜上所述，本研究表明丹參通絡(luò)解毒湯與動員骨髓干細胞相結(jié)合治療心肌IRI具有協(xié)同增效、優(yōu)勢互補作用，為中醫(yī)藥促進骨髓干細胞動員，防治冠心病研究提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

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Protective Effect of Danshen Tongluo Jiedu Decoction Combined with Bone Marrow Stem Cells Mobilization on the Vascular Endothelial Cells in Rats with Myocardial Ischemia Reperfusion Injury

LI Xinhui，HUANG Miaoxin，DU Jianfang，HUANG Zhengde，XU Fuli，XIAO Qing，GUO Chenhe,LI Caiyun
(Hunan University of Chinese Medicine，Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of Danshen Tongluo Jiedu decoction combined with bone marrow stem cells mobilization on vascular endothelial cells through observing the changes of NO level,eNOS protein and mRNA eNOS expression in rats with myocardial ischemia reperfusion injuryMethodsThe 60rats were randomly divided into sham-operation group,model group,rhEPO mobilization group,Danshen Tongluo Jiedu decoction (DTJD)group,and DanShen TongLuo JieDu decoction combined with rhEPO mobilization(DTJr)group,12rats in each group.After 14days of modeling,the NO level was determiened by radioimmunaossay.The expression of eNOS protein was assessed by immunocytochemistry method,and eNOS mRNA was measured by real-time fluorescence quantitative PCR method.ResultsCompared with sham-operation group,the levels of NO,eNOS and eNOS reduced significantly(P＜0.01).Compared with the IRI group,the levels of NO,eNOS protein and mRNA eNOS expression in rhEPO mobilization group,DTJD group and DTJDr group increased significantly,the differences were statistically significant(P＜0.01).Cmpared with rhEPO mobilization group and DTGD group,the level of NO,eNOS protein and mRNA eNOS expression in DTJr group increased significantly,the differences were statistically significant(P＜0.01)ConclusionDTJD could improve the expression of eNOS mRNA in endothelial cells and further promote expression of eNOS protein.It is may be one of the mechanisms of protecting endothelial cells in rats with myocardial ischemia reperfusion injury.DTJD combined with mobilization agent could enhance the protective effect on endothelial cells.

endothelial cells;myocardial ischemia reperfusion injury;bone marrow stem cells;DanShen TongLuo JieDu decoction

本文引用：李鑫輝，黃淼鑫，杜建芳，黃政德，許福麗，肖 青，郭晨鶴，李彩云.丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合骨髓干細胞動員對心肌缺血再灌注損傷大鼠內(nèi)皮的保護作用[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，37（10）：1070-1073.

R285.5；R541.4

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.010.005

2016-12-21

國家自然科學(xué)基金面上項目(30973750)；湖南省教育廳科學(xué)研究研重點項目（15A143）;湖南省中醫(yī)藥科研計劃項目（201559）;湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新課題(2016cx21)。

李鑫輝，男，博士，副教授，主要從事心血管疾病研究，E-mail:3077314414@qq.com。

（本文編輯 楊 瑛）