不同芍藥甘草配伍用于潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用及機(jī)制研究

陳曉峰，謝 君*

（張家港市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，江蘇 張家港 215600）

不同芍藥甘草配伍用于潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用及機(jī)制研究

陳曉峰，謝 君*

（張家港市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，江蘇 張家港 215600）

目的研究不同芍藥甘草配伍用于潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)的治療作用及機(jī)制。方法納入90只實(shí)驗(yàn)小鼠作為研究對(duì)象，隨機(jī)抽簽分為觀察1組、觀察2組及對(duì)照組，各30只。觀察1組和觀察2組采用乙酸法建立UC小鼠模型，分別以3∶1和1∶1比例配伍芍藥甘草，以芍藥甘草湯進(jìn)行干預(yù)。對(duì)照組正常飼養(yǎng)，未行其他干預(yù)。記錄3組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)及結(jié)腸組織核因子-kBp65(NF-kBp65)，比較觀察1組和觀察2組小鼠結(jié)腸收縮頻率、扭體次數(shù)、炎性細(xì)胞數(shù)、炎性細(xì)胞面積、平均光密度及平均黑度總和。結(jié)果觀察1組給藥30min和1h后結(jié)腸收縮頻率和扭體次數(shù)顯著低于觀察2組和給藥前（P＜0.05）。觀察1組胸腺和脾臟指數(shù)均高于觀察2組，結(jié)腸組織NF-kBp65低于觀察2組（P＜0.05）。觀察1組炎性細(xì)胞數(shù)、炎性細(xì)胞面積、平均光密度及平均黑度總和均顯著低于觀察2組（P＜0.05）。結(jié)論3∶1比例配伍芍藥甘草較1∶1比例配伍的芍藥甘草湯用于治療UC，其止痛止瀉效果更佳，這可能與控制炎性浸潤、刺激免疫器官分泌免疫細(xì)胞，抑制NF-kBp65激活有關(guān)。

芍藥；甘草；潰瘍性結(jié)腸炎

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)屬非特異性炎癥性疾病，主要累及黏膜和黏膜下層，臨床以腹瀉、腹痛、便血為主要表現(xiàn)，屬中醫(yī)“腸癖、臟毒”范疇。既往認(rèn)為腸癖多因脾胃虛弱、氣血阻滯而致，本虛標(biāo)實(shí)、脾虛濕盛為本病病理基礎(chǔ)[1]。芍藥甘草湯出自傷寒論，以調(diào)和肝脾、緩急止痛為主要功用，臨床在UC、萎縮性胃炎等消化系統(tǒng)疾病中得到廣泛應(yīng)用[2]。芍藥、甘草是方劑芍藥甘草湯主要組成藥物，目前，臨床對(duì)芍藥、甘草的不同配伍療效認(rèn)識(shí)尚有爭(zhēng)議，且缺乏對(duì)其作用機(jī)制的研究[3]。既往多認(rèn)為1∶1比例可達(dá)到理想緩急止痛效果，但近年來有報(bào)道認(rèn)為3∶1療效可能更好[4]。為此，本研究納入90只小鼠，建立UC小鼠模型，分析芍藥、甘草不同配伍比例的芍藥甘草湯對(duì)UC的治療效果及作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)小鼠均由廣西藥學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，合格證號(hào)：08A038。觀察1組30只，雌性17只，雄性13只；年齡 （12.54±3.68）周；體質(zhì)量 （214.51±20.84）g。觀察2組30只，雌性16只，雄性14只；年齡（13.02±3.71）周；體質(zhì)量（220.17±22.36）g。對(duì)照組 30 只，雌雄各 15 只，年齡（12.77±3.54）周，體質(zhì)量（209.36±21.17）g。3組小鼠性別、年齡及體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 UC小鼠建模

觀察1組和觀察2組小鼠禁食24h，行戊巴比妥鈉腹腔麻醉，成功后清潔灌腸，用尼龍導(dǎo)管經(jīng)肛門插入結(jié)腸8cm處，注入5%冰乙酸溶液1mL，間隔2d，連續(xù)重復(fù)4次。然后正常飼養(yǎng)2周。期間對(duì)照組正常飼養(yǎng)。

1.3 治療藥物及方法

觀察1組配方:芍藥0.6g/kg，甘草0.2g/kg；觀察2組配方:芍藥0.2g/kg，甘草0.2g/kg。兩組分別按上述配方取藥材10g，加入10倍量清水浸泡煮沸30min，過濾分離，取上清液，冷凍干燥，備用。兩組均從飼養(yǎng)結(jié)束后第10天開始給藥，用生理鹽水每日灌胃1次，按3g/（kg·d）劑量給小鼠灌服芍藥甘草湯煎劑混懸液，分2次灌服，連續(xù)給藥3d。給藥結(jié)束后即可開始記錄小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)。

1.4 病理標(biāo)本切片檢測(cè)

觀察1組和觀察2組給藥完成后禁食12h，用烏拉坦800mg/kg行小鼠尾靜脈淺麻醉，沿腹中線做3cm切口，找出結(jié)腸段兩端并用縫合線固定在腸管固定管兩側(cè)小孔上，縫合線一端從腸管固定管中央穿出連接BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，放回腹腔，記錄結(jié)腸收縮頻率。3組小鼠灌胃后1d內(nèi)處死，取近肛門端3cm處結(jié)腸作為病理標(biāo)本。切片4 μm，行HE染色，以平均吸光度反應(yīng)評(píng)定核因子-kBp65(NF-kBp65)活性。摘取脾臟、胸腺，計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。將觀察1組和2組小鼠標(biāo)本置于20×10倍視野光鏡下觀察炎性細(xì)胞浸潤區(qū)域，采用MIAS 2 000型計(jì)算機(jī)圖形系統(tǒng)測(cè)定炎性細(xì)胞數(shù)量、面積、平均光密度及平均黑度總和。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

選用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以“±s”表示，多時(shí)點(diǎn)對(duì)比采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，單一時(shí)點(diǎn)的對(duì)比采用多變量的方差分析，兩組間比較行t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸收縮頻率和扭體次數(shù)比較

給藥后，兩組各時(shí)間點(diǎn)(30min,1h)結(jié)腸收縮頻率和扭體次數(shù)均減少（P＜0.05）。觀察 1組給藥30min和1h后結(jié)腸收縮頻率和扭體次數(shù)顯著低于觀察2組（P＜0.05）。見表1。

2.2 3組免疫指標(biāo)比較

表1 結(jié)腸收縮頻率和扭體次數(shù)比較 （n=30，±s）

表1 結(jié)腸收縮頻率和扭體次數(shù)比較 （n=30，±s）

注：與給藥前比較，*P＜0.05；與觀察 2 組比較，△P＜0.05。

組別觀察1組觀察2組項(xiàng)目收縮頻率/（次/min）扭體次數(shù)/（次/20min）收縮頻率/（次/min）扭體次數(shù)/（次/20min）給藥前1h 165.33±25.58 35.69±5.22 167.04±21.39 36.13±6.71給藥30min后146.42±20.31*△20.26±4.18*△158.68±20.73*33.79±5.59*給藥1h后130.29±18.85*△14.73±3.92*△142.88±18.21*22.87±4.46*F 23.714 19.671 18.639 17.443P 0.000 0.000 0.000 0.000

觀察1組與對(duì)照組比較胸腺指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。觀察1組和2組脾臟指數(shù)和結(jié)腸組織 NF-kBp65 均高于對(duì)照組（P＜0.05）。觀察 1 組胸腺和脾臟指數(shù)均高于觀察2組，結(jié)腸組織NF-kBp65 低于觀察 2 組（P＜0.05）。見表2。

2.3 兩組炎性指標(biāo)比較

觀察1組炎性細(xì)胞數(shù)、炎性細(xì)胞面積、平均光密度及平均黑度總和均顯著低于觀察2組，差異有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見表3。

表2 3組免疫指標(biāo)比較 （n=30，±s）

表2 3組免疫指標(biāo)比較 （n=30，±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與觀察 2 組比較，△P＜0.05。

組別觀察1組觀察2組對(duì)照組F P胸腺指數(shù)/（mg/10g）0.23±0.07△0.18±0.03*0.26±0.08 12.584 0.001脾臟指數(shù)/(mg/10g)0.68±0.13*△0.56±0.09*0.34±0.05 15.584 0.000結(jié)腸組織NF-kBp65 0.04±0.01*△0.06±0.02*0.02±0.01 17.302 0.000

表3 兩組炎性指標(biāo)比較 （n=30，±s）

表3 兩組炎性指標(biāo)比較 （n=30，±s）

注：與觀察 2 組比較，*P＜0.05。

組別觀察1組觀察2組t P炎性細(xì)胞數(shù)/個(gè)281.37±65.13*353.72±89.24 3.587 0.001炎性細(xì)胞面積/μm2 3 424.13±576.48*5 509.56±781.23 11.765 0.000平均光密度30 976.85±4 452.92*34 012.23±5 124.76 2.449 0.017平均黑度總和35 162.08±4 872.36*42 158.29±5 516.97 5.206 0.000

3 討論

UC與自身免疫性疾病、遺傳及感染等因素密切相關(guān)[5]，但其具體機(jī)制尚未完全闡明，是臨床難治性疾病之一。目前，免疫抑制劑、激素及手術(shù)外科治療療效不甚滿意，且毒副作用較多[6]。近年來，中醫(yī)藥逐漸引起臨床重視，芍藥甘草湯作為緩急止痛的經(jīng)典方劑在UC中得到廣泛應(yīng)用[7]。本研究對(duì)比不同配伍劑量芍藥甘草湯在UC中的療效，結(jié)果顯示觀察1組給藥30min和1h后小鼠結(jié)腸收縮頻率和扭體次數(shù)均顯著低于給藥前和觀察2組，提示3∶1比例配伍芍藥甘草湯用于UC模型小鼠對(duì)結(jié)腸蠕動(dòng)亢進(jìn)具有明顯拮抗性抑制作用，能緩解結(jié)腸痙攣性蠕動(dòng)，從而發(fā)揮止痛止瀉作用。楊艷等[8]研究也認(rèn)為大劑量芍藥甘草配伍能直接影響回腸平滑肌頻率和張力變化率，增強(qiáng)解痙止痛效果，與本文結(jié)論相符。

胸腺和脾臟是機(jī)體重要免疫器官，分別通過分泌胸腺素和T淋巴細(xì)胞參與細(xì)胞免疫[9]。胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)指每10g體重臟器的重量，對(duì)評(píng)價(jià)淋巴細(xì)胞增殖能力具有重要意義[10]。本研究中，觀察1組與對(duì)照組胸腺指數(shù)無顯著性差異，提示3∶1比例配伍芍藥甘草湯能刺激UC小鼠受損胸腺的細(xì)胞增殖，對(duì)恢復(fù)和調(diào)節(jié)免疫機(jī)能有重要意義。另外，有研究還認(rèn)為芍藥甘草及柴胡配伍能發(fā)揮協(xié)同作用[11]，有助于增強(qiáng)免疫功能。脾臟被認(rèn)為是機(jī)體細(xì)胞免疫中心，芍藥甘草配伍能提高腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率，促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和溶血素的形成[12]。本研究顯示觀察1組和2組脾臟指數(shù)顯著高于對(duì)照組，而觀察1組較2組更為明顯，說明芍藥甘草湯對(duì)恢復(fù)機(jī)體免疫功能作用顯著，芍藥甘草3∶1配伍較1∶1比例效果更好。徐曉娟等[13]也認(rèn)為3∶1配伍較1∶1比例能通過升高血漿-β內(nèi)啡肽而達(dá)到更好的止痛效果，與本文結(jié)論一致。NF-kB異常活化在UC病理進(jìn)展中具有重要作用[14]，本研究顯示觀察1組和2組結(jié)腸組織NK-kBp65均高于正常對(duì)照組，提示建模成功，而觀察1組NF-kB顯著低于2組，提示3∶1配伍芍藥甘草抑制NF-kBp65激活作用優(yōu)于1∶1配伍組。

潰瘍、糜爛是UC的主要病理變化，炎性浸潤是UC診斷治療的主要依據(jù)[15]。甘草內(nèi)含甘草甜素具有腎上腺皮質(zhì)激素樣作用[16]，因而具有抗變態(tài)反應(yīng)，抑菌消炎作用。炎性細(xì)胞面積和平均光密度能對(duì)結(jié)腸黏膜潰瘍和炎癥程度進(jìn)行定量、客觀、精準(zhǔn)評(píng)估[17]。本研究中，觀察1組炎性細(xì)胞數(shù)、炎性細(xì)胞面積、平均光密度及平均黑度總和均顯著低于觀察2組，提示觀察1組在改善炎癥病理狀態(tài)，抑制結(jié)腸黏膜潰瘍進(jìn)展方面效果優(yōu)于2組。

綜上所述，芍藥甘草湯能顯著改善UC腹瀉、疼痛癥狀，以3∶1比例配伍芍藥甘草較1∶1比例配伍療效更為顯著，這可能與控制炎性浸潤，刺激免疫器官分泌免疫細(xì)胞，抑制NF-kBp65激活有關(guān)。

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Study on Therapeutic Effect and Mechanism of Different Compatibility of Peony and Licorice on Ulcerative Colitis

CHEN Xiaofeng,XIE Jun*
(Department of pharmacy,Zhangjiagang Traditional Chinese Medicine Hospital,Zhangjiagang,Jiangsu 215600,China)

ObjectiveTo study the therapeutic effect and mechanism of different compatibility of peony and licorice on ulcerative colitis (UC).MethodsThe 90experimental mice were randomly divided into the No.1observation group,No.2observation group,and control group,30mice in each group.The UC model mice of the No.1observation group and No.2observation group were built by the acetic acid method,intervened with interved peony Licorice decoction,the compatibility of peony and licorice with 3∶1and 1∶1in the two groups.The control group was fed normally without other interventions.The thymus spleen index and colonic tissue nuclear factor-kBp65(NF-kBp65)were recorded in three groups,the colonic contraction fre quency,writhing,inflammatory cell number,size,density and average total blackness between No.1observation group and No.2observation group were observed.ResultsThe colonic contraction frequency and writhing frequency in No.1observation group after giving medicine for 30minutes and 1hour were lower than the control group and before drug administration(P＜0.05).The thymus and spleen indexes in No.1observation group were higher than that in the No.2observation group,and colon tissue NF-kBp65 was lower than the No.紙="1075"/> c group (P＜0.05).The number of inflammatory cells,inflammatory cell area,the average optical density and the average total blackness of the No.1observation group were significantly lower than those in No.2observation group(P＜0.05).ConclusionThe 3∶1proportion of peony and licorice are more effective in improving the pain and diarrhea than 1∶1ratio in the treatment for UC.This may be related to controlling inflammatory infiltration,stimulating immune organ secreting immune cells and inhibiting NF-kB activation.

peony;licorice;ulcerative colitis

本文引用：陳曉峰，謝 君.不同芍藥甘草配伍用于潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用及機(jī)制研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（10）：1074-1077.

R259；R285.6

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2017.010.006

2016-12-26

江蘇省自然科學(xué)基金計(jì)劃(815269)。

陳曉峰,男,本科,副主任藥師,主要從事藥學(xué)研究。

*謝 君,女，主管藥師，E-mail：262229220@qq.com 。

（本文編輯 李 杰）