壯骨止痛膠囊含藥血清對成骨細胞CDK4和p21表達的影響

李迎秋,蔣艷菲,張叔琦,趙雪君,曹 卉,楊 雪,卓海燕,張國民*

(湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

壯骨止痛膠囊含藥血清對成骨細胞CDK4和p21表達的影響

李迎秋,蔣艷菲,張叔琦,趙雪君,曹 卉,楊 雪,卓海燕,張國民*

(湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

目的觀察壯骨止痛膠囊含藥血清對成骨細胞CDK4和p21表達的影響，探討壯骨止痛膠囊治療骨質疏松癥的機制。方法40只SD雌性大鼠隨機分為模型組、陽性對照組、壯骨止痛膠囊組、假手術組，每組10只。模型組、陽性對照組以及壯骨止痛膠囊組的SD大鼠制作骨質疏松大鼠模型，假手術組SD大鼠作為對照。不同組SD大鼠喂養不同藥物，假手術組和模型組大鼠灌胃生理鹽水，陽性對照組灌胃尼爾雌醇，壯骨止痛膠囊組灌胃壯骨止痛膠囊藥物，連續喂養13周之后，處死大鼠，提取各組大鼠含藥血清備用。另取5只新生SD小鼠顱骨的成骨細胞，應用上述各組含藥血清進行細胞培養，連續培養3代后，采用堿性磷酸酶染色和茜素紅染色法鑒定成骨細胞，細胞免疫組化法檢測各組含藥血清培養的成骨細胞CDK4蛋白和p21蛋白的表達。結果CDK4和p21蛋白陽性表達主要在成骨細胞的細胞核。與假手術組比較，模型組CDK4表達輕度降低，p21表達輕度升高（P＞0.05）；與模型組比較，陽性對照組和壯骨止痛膠囊組 CDK4表達均升高，p21表達均下降（P＜0.01）；與陽性對照組比較，壯骨止痛膠囊組CDK4表達升高，p21表達下降（P＜0.01）。結論壯骨止痛膠囊可通過提高成骨細胞CDK4的表達，抑制p21的表達，從而增加成骨細胞G1期調節蛋白的表達，推動增殖周期的完成，達到治療骨質疏松癥的目的。

CDK4；p21；壯骨止痛膠囊；骨質疏松癥

骨質疏松癥是指由于單位體積內骨量減少、骨組織顯微結構明顯衰退、骨密度降低等引起骨折危險性增加的全身性骨代謝疾病[1]。有關資料顯示[2-3]，隨著社會人口老齡化趨勢，骨質疏松癥患者日益劇增。骨質疏松癥在中醫學認識上近似于中醫學“骨痿”病。多屬虛證，病位在骨，與肝腎脾密切相關[4]。治療原則是補肝腎、強筋骨。壯骨止痛膠囊，具有補益肝腎、壯骨止痛功效，能有效治療骨質疏松癥[5]。但其具體作用機制尚無文獻完全闡明。本試驗擬通過研究壯骨止痛膠囊對體外成骨細胞G1期調節蛋白CDK4和p21表達的影響及其作用，探討其抗骨質疏松癥的具體作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級6月齡的雌性SD大鼠40只，新生SD小鼠5只。湖南斯萊克景達有限公司提供，許可證號SCXK（湘）2011-0003。大鼠飼養在湖南中醫藥大學實驗動物中心清潔級屏障系統動物房里，室溫18～25℃，濕度40%～70%，標準普通飼料喂養（湖南中醫藥大學實驗動物中心提供）。

1.2 實驗藥品

壯骨止痛膠囊（由補骨脂、淫羊藿、女貞子、川牛膝、枸杞子、狗脊、骨碎補組成）由湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科制備，批號980305，含藥劑量相當于生藥 13.2g/（kg·d）。陽性對照藥物為尼爾雌醇片（北京四環制藥有限公司生產，國藥準字H11020124）,劑量為 0.117mg/（kg·d）。

1.3 主要實驗試劑與儀器

即用型兔抗大鼠CDK4多克隆抗體，小鼠抗大鼠p21多克隆抗體；山羊抗兔抗體；0.25%胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、低糖DMEM培養基、小牛血清、青／鏈霉素、SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術有限公司）；50mm細胞培養瓶、巴式管、24孔板、15mmBD管、5mL凍存管、50mmBD管均購自武漢博士德生物工程有限公司；電熱恒溫培養箱（長沙實驗電爐廠），電熱恒溫干燥箱 （上海市實驗儀器總廠），離心機、倒置相差顯微鏡（MOTIC）、酶標儀、電泳儀（北京市六一儀器廠）。

2 方法

2.1 制備含藥血清

取40只SD雌性大鼠隨機分為模型組、陽性對照組、壯骨止痛膠囊組和假手術組，每組10只。模型組、陽性對照組以及壯骨止痛膠囊組的SD大鼠按照文獻[6]制作骨質疏松大鼠模型，假手術組SD大鼠作為對照。不同組SD大鼠喂養不同藥物，假手術組和模型組大鼠灌胃生理鹽水、陽性對照組灌胃尼爾雌醇、壯骨止痛膠囊組灌胃壯骨止痛膠囊藥物。給藥劑量及方法：灌胃給藥劑量按人-鼠體表面積折算成相當于人日用臨床劑量，壯骨止痛膠囊給藥劑量相當于生藥 13.2g/(kg·d）,用 2mL 生理鹽水溶解，給壯骨止痛膠囊組大鼠灌胃；尼爾雌醇片給藥劑量為 0.117mg/(kg·d），用 2mL 生理鹽水溶解后給陽性對照組大鼠灌胃；模型組、假手術組大鼠灌胃等量生理鹽水2mL；每天上午8：00～9：00灌胃給藥 1次，每次2mL。其余食物及飲水按需喂養，連續給藥13周后，在大鼠腹主動脈無菌取血，取得的血液在4℃下靜置30min后離心30min。取離心后的上層血清，于56℃水浴 30min滅活，同組血清混勻，經 0.45 μm、 0.22 μm 一次性濾膜抽濾除菌,每管5mL分裝，-20℃保存備用。

2.2 成骨細胞的分離和培養

取新生SD小鼠5只，在75%乙醇溶液中浸泡5min消毒后取出小鼠頭骨，在PBS緩沖液中處理至骨片透明，剪碎為1mm3骨碎片，0.25%胰酶預消化30min，放入離心機中離心10min，去上清液，加入PBS液洗滌1次，再加入0.1%Ⅱ型膠原酶，37℃水浴消化1h，每30min振蕩1次，緊接著離心3min，去上清液，再加PBS液洗滌1次，移入培養瓶中加入培養液在5%CO2，37℃條件繼續培養。每日定時定次觀察細胞生長和污染狀況，每4天換液1次。待細胞融合后，用25%胰蛋白酶消化細胞，制成細胞懸液，取懸浮液于培養瓶中貼壁培養，多次重復操作，取第3代細胞進行實驗。

2.3 含藥血清的添加

取第3代成骨細胞經0.25%胰酶消化后，將細胞懸液以終濃度2×104/mL接種到24孔培養板中進行貼壁培養；細胞貼壁后，棄去含血清的培養基，單純DMEM培養基培養饑餓24h，24h后將細胞培養液換為含15%各組含藥血清的培養液，根據所更換的含藥血清的不同將培養的成骨細胞分為模型組、陽性對照組、壯骨止痛膠囊組、假手術組，每組12孔，每3天換含藥血清的培養液1次，連續培養18d后，棄去上清液，收集各組成骨細胞用于堿性磷酸酶染色和茜素紅染色，并應用細胞免疫組化法檢測各組成骨細胞CDK4和p21蛋白的表達。

3 結果

3.1 成骨細胞鑒定

3.1.1 堿性磷酸酶染色結果 各組體外培養的成骨細胞具有堿性磷酸酶活性，經重氮鹽法堿性磷酸酶染色后，細胞漿著色呈墨綠色，細胞呈多角形，是典型的成骨細胞形態，如圖1。

圖1 成骨細胞堿性磷酸酶染色結果（×100）

3.1.2 茜素紅染色結果 各組體外培養的成骨組胞進行茜素紅染色后，呈紅色的鈣化結節，其中假手術組、陽性對照組、壯骨止痛膠囊組的鈣化結節明顯多于模型組，如圖2。

圖2 成骨細胞茜素紅染色組結果（×100）

3.2 各組大鼠CDK4和p21蛋白的表達水平

CDK4和p21蛋白檢測結果顯示，CDK4和p21蛋白陽性表達主要在成骨細胞的細胞核，見圖3、圖4。與假手術組比較，模型組CDK4表達降低，p21表達升高；與模型組比較，陽性對照組和壯骨止痛膠囊組CDK4表達均升高，p21表達均下降（P＜0.01）；與陽性對照組比較，壯骨止痛方組 CDK4表達升高，p21 表達下降（P＜0.01）。見表1。

圖3 各組大鼠成骨細胞CDK4蛋白的表達光鏡圖（免疫組化×400）

圖4 各組大鼠成骨細胞p21蛋白的表達光鏡圖（免疫組化×400）

表1 各組大鼠CDK4和p21蛋白的表達 （n=10，±s，%）

表1 各組大鼠CDK4和p21蛋白的表達 （n=10，±s，%）

注：與模型組比較，△P＜0.01；與陽性對照組比較，＃P＜0.01。

組別模型組假手術組陽性對照組壯骨止痛膠囊組CDK4蛋白11.35±1.48 11.97±1.56*17.96±1.89△18.30±1.93△＃p21蛋白18.30±1.87 18.01±1.92*11.98±1.56△11.35±1.49△＃

4 討論

原發性骨質疏松癥是以骨量減少、骨的微觀結構退化為特征，致使骨脆性增加以及易于發生骨折的一種全身性骨骼疾病[6-7]。目前，骨質疏松癥是一個全世界范圍內越來越重要的社會健康問題，骨質疏松癥已成為世界十大常見病。因此，預防和治療骨質疏松癥的藥物開發與研究已成為醫藥研究的熱點和重點。隨著年齡的增長，中、老年人激素分泌日益減少，如雌激素、雄激素、甲狀腺素、皮質類固醇激素、鈣調節激素、生長激素等缺乏是導致骨質疏松癥的重要原因。近年來，關于細胞周期的研究有許多重大突破，現已發現并確立了Cyclin、CDK和CKI的細胞周期G1期蛋白調控機制，核心是CDK-Cyclin系統，即細胞的生長過程中進入G1期后，是繼續進入S期還是停滯于G1期，這取決于CDK4/6-Cyclin D1復合體的形成與活性，有研究已證明[7],Cyclin D1是G1期蛋白增殖的關鍵蛋白。有國外學者Fujita[8]在研究大鼠雌激素對成骨細胞的影響機制中發現雌激素誘導能提高CDK4/6的活性進而促進骨細胞的生長。國內學者祝頌松等[9]在研究下頜牽張成骨的實驗中發現了血清CDK4水平明顯升高。吳銀生等[10-11]研究發現，在去卵巢骨質疏松大鼠的各個時期的監測中，發現成骨細胞調節蛋白Cyclin D1、CDK4蛋白的陽性高表達，提示雌激素嚴重缺乏時，進入增殖周期的成骨細胞增多且增殖加快；p21的陽性高表達則更為顯著，阻滯成骨細胞增殖周期G1期進程。故通過研制保證成骨細胞正常功能的藥物來防治骨質疏松癥，并在細胞水平探討治療骨質疏松癥這一類藥物的作用環節與機制，是預防和治療骨質疏松癥的重要醫學研究和防治途徑。在中醫學理論中，骨質疏松癥為“骨痿”“骨枯”“骨痹”“腰背痛”等[12-13]。中醫學理論認為，骨質疏松癥的病因病機為腎虧脾虛，認為腎藏精主骨，腎精減少，骨髓化源不足，不能營養骨骼而致骨髓空虛，從而導致骨質疏松癥的發生；《素問·痿論》曰：“脾主身之肌肉”，肌肉豐滿壯實，則骨骼健壯有力，脾虛則致“骨枯”。壯骨止痛膠囊是由壯骨止痛方結合現代中藥藥理研究，并遵循傳統中醫理論研制而成的中成藥,具有壯骨止痛方同樣的功效[14-17]。本試驗通過觀察壯骨止痛膠囊對體外成骨細胞G1期調節蛋白CDK4和p21表達的影響及其作用。結果表明，壯骨止痛膠囊組成骨細胞的CDK4蛋白陽性表達高于其他組，p21的表達低于其他組，且主要在成骨細胞的細胞核。說明壯骨止痛膠囊通過調節成骨細胞周期G1期CDK4和p21蛋白的表達，調節成骨細胞G1期蛋白，推進細胞周期進程，促進成骨細胞增殖分化，達到治療骨質疏松的效果。以上可能是壯骨止痛膠囊治療骨質疏松癥的基本作用機制。

[1]麗 榮.淺談絕經后骨質疏松癥的中醫藥治療[J].內蒙古中醫藥,2014,33(29):9.

[2]何春江,張德洲,李君誠.橈遠骨折、髖部骨折、胸腰段壓縮性骨折在門、急診骨折患者中40歲以上人群的發病情況分析報告[A].第十八屆全國中西醫結合骨傷科學術研討會論文匯編[C],中國中西醫結合學會、中國中西醫結合學會骨傷科專業委員會,2011:1.

[3]瞿寧厚,楊曉清,張進陶，等.門、急診骨折病人中40歲及以上人群橈遠和髖部骨折的發病情況報告[A].2012年四川省中醫骨傷科學術年會論文集[C].四川中醫骨傷科專業委員會，2012:227-228.

[4]黃雪青，李 芮.從肝脾腎論治老年性骨質疏松癥[J].大家健康（學術版）,2015,9(3):34-35.

[5]彭瓊輝,黃艷華,嚴 超,等.壯骨止痛方治療絕經后骨質疏松癥50例臨床觀察[J].湖南中醫雜志,2016，32（8）:16-17.

[6]邢志軍,陳德喜,趙景明.壯骨顆粒對去卵巢大鼠骨質疏松癥的影響[J].中國當代醫藥,2014，21（6）:8-10，14.

[7]Matsushime H,Roussel MF,Ashmun RA,et al.Colony-stimulating factor 1regulates novel cyclin druring the G1 phase of the cell Cyclin[J].Cell，1991，65（4）:701-713.

[8]Fujita M,Urano T,Horie K,et al.Estroger activates cyclin-dependent kinases 4and 6through induction of cyclin D in rat primary osteoblasts[J].Biochemical Biophysical Research Communications，2002,299(2):222-228.

[9]祝頌松,胡 靜,李繼華,等.細胞周期調節蛋白在下頜牽張成骨過程中的表達及作用[J].口腔醫學研究,2005,21(5):498-500.

[10]吳銀生,林燕萍,盧天祥，等.去卵巢骨質疏松大鼠成骨細胞G1期調節蛋白的改變[J].中國組織工程研究與臨床康復,2010,14(15):2675-2679.

[11]吳銀生.成骨細胞G1期調節蛋白與絕經后骨質疏松癥關系及中藥干預作用的實驗研究[D].福州：福建中醫學院,2008:30-51.

[12]曾 英,李偉娟,章文娟,等.壯骨止痛膠囊對去卵巢骨質疏松大鼠骨組織Treg/Th17平衡的調節作用[J].北京中醫藥大學學報,2016，39（7）:555-561.

[13]李東濤,王 劍,姜洪洋,等.骨質疏松癥常見中醫定性證候輕重程度量化評價[J].中西醫結合學報,2012,10(11):1254-1262.

[14]李東濤,李富玉,王 劍，等.骨質疏松癥中醫證候療效評價方法研究[J].中醫雜志,2013,54(13):1110-1114.

[15]劉平安,戴瑜娉,孟小莎,等.基于TGF-β-Smad通路探討壯骨止痛方對絕經后骨質疏松癥的治療[J].湖南中醫藥大學學報,2016，36（7）:31-34.

[16]莫新民,曾 英,彭瓊輝,等.壯骨止痛膠囊治療去卵巢雌鼠骨質疏松癥療效的實驗研究[J].中國中醫基礎醫學雜志,2007，13（3）:195-198.

[17]章才干.壯骨止痛膠囊治療骨質疏松癥40例[J].中醫雜志,2013,54(16):1417-1418.

Effect of Zhuanggu Zhitong Capsule Medicated Serum on the CDK4 and p21 Expression of Osteoblasts

LI Yingqiu,JIANG Yanfei,ZHANG Shuqi,ZHAO Xuejun,CAO Hui,YANG Xue,ZHUO Haiyan,ZHANG Guomin*
(Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo obseve the effect of Zhuanggu Zhitong capsule medicated serum on the CDK4 and p21 expression of osteoblasts,and investigate its mechanism of action on osteoporosis.MethodsForty female SD rats were randomly divided into model group,positive control group,Zhuanggu Zhitong capsule group and sham-operation group,e edic in each group.The SD osteoblasts model rats excluding rats in sham-operation group were built,and shamp-operation group as the control.Rats in sham-operation and model groups were given normal saline by gavage,rats in the positive control group were administrated with nylestriol,and rats in Zhuanggu Zhitong capsule group were

with Zhuanggu Zhitong capsule.After continuous feeding for 13weeks,the rats were executed,and then the medicated serum from all rats were prepared.Osteoblasts which obtained from five newborn SD neonatal rats were cultured with the medicated serum to the third generation.The osteoblasts were identified by the alkaline phosphatase dye and the alizarin red dye.The expression of CDK4 protein and p21 protein was detected by immunohistochemistry.ResultsThe positive expressions of CDK4 and p21 were mainly in the nucleus of osteoblasts.In comparison with the sham-operation group,the expression of CDK4 in the model group decreased slightly,and the expression of p21 increased slightly (P＞0.05).Compared with the model group,CDK4 expression increased and p21 expression decreased in the positive control group and Zhuanggu Zhitong capsule group (P ＜0.01).The CDK4 expressions in Zhuanggu Zhitong capsule group were higher than those in the positive control group,while the p21 expression in Zhuanggu Zhitong capsule group were significantly lower than those in the positive control group(P＜0.01).ConclusionZhuanggu Zhitong capsule could improve CDK4 expression of osteoblasts,and inhibit the expression of p21,thereby increase the expression of osteoblast G1 phase regulatory protein,promote the proliferation cycle,and then achieve the purpose of treatment of osteoporosis.

CDK4； p21； Zhuanggu Zhitong capsule;osteoporosis

本文引用：李迎秋，蔣艷菲，張叔琦，趙雪君，曹 卉，楊 雪，卓海燕，張國民.壯骨止痛膠囊含藥血清對成骨細胞 CDK4和 p21表達的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（10）：1078-1081.

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.010.007

2016-10-12

2014年湖南省教育廳科學研究優秀青年項目（14B130）；2015年度湖南省大學生研究性學習和創新性實驗計劃項目（2015217,2015220）；2016年度湖南省中醫藥科研計劃重點項目（201612）。

李迎秋，女，博士，講師，主要從事中醫老年病研究。

* 張國民，男，博士，教授，碩士研究生導師，E-mail：834095773@qq.com。

（本文編輯 李 杰）