血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及對(duì)氧磷酶1基因多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變的相關(guān)性*

衛(wèi)欽鋒，李先加

（1.西寧市第二人民醫(yī)院眼科 810003；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院藏醫(yī)學(xué)院藏醫(yī)系，西寧 810003）

論著·臨床研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.30.015

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及對(duì)氧磷酶1基因多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變的相關(guān)性*

衛(wèi)欽鋒1，李先加2

（1.西寧市第二人民醫(yī)院眼科 810003；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院藏醫(yī)學(xué)院藏醫(yī)系，西寧 810003）

目的探討血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、對(duì)氧磷酶1（PON1）基因多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）的相關(guān)性。方法選取2013年1月至2015年12月西寧市第二人民醫(yī)院收治的糖尿病（DM）患者168例，將其分為DM組（48例）、增殖性DR（PDR）組（66例）和非增殖性DR（NPDR）組（54例）；另選取同期體檢健康者104例作為對(duì)照組（NC組）。通過聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）測(cè)定血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和對(duì)氧磷酶1（PON1）基因多態(tài)性，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所有受試者超氧化歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）水平。結(jié)果與NC組比較，DM組、NPDR組及PDR組收縮壓、糖化血紅蛋白水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而舒張壓、膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。PDR組和NPDR組收縮壓比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而舒張壓、膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白、糖化血紅蛋白水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。CC、CT、TT基因型患者DR發(fā)生率分別為71.05%、56.27%、38.64%，CC基因型患者DR發(fā)生率明顯高于CT和TT基因型患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。PON1 192位點(diǎn)不同基因型健康體檢者SOD、MDA水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），QQ基因型DR患者體內(nèi)SOD水平低于QR、RR基因型患者，MDA水平高于QR、RR基因型患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論VEGF、PON1基因的表達(dá)影響DR的發(fā)生和進(jìn)展，PON1基因可能通過影響DR患者體內(nèi)氧化應(yīng)激酶的表達(dá)控制疾病的發(fā)展。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；對(duì)氧磷酶1；多態(tài)性，單核苷酸；糖尿病視網(wǎng)膜病變

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是一種具有特異性的糖尿病（DM）微血管病變，是DM的并發(fā)癥之一[1-2]。臨床上將DR分為非增殖性DR（NPDR）和增殖性DR（PDR），前者無視網(wǎng)膜新生血管增生，而后者有視網(wǎng)膜新生血管增生，醫(yī)學(xué)上認(rèn)為NPDR是PDR的前期[3-5]。DR的致盲概率大，據(jù)統(tǒng)計(jì)約10%的DR患者會(huì)喪失視力。我國(guó)DM患病率逐年升高，因此，研究DR的發(fā)病機(jī)制與治療方法具有重要意義。目前研究表明，DR的發(fā)生與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及對(duì)氧磷酶1（paraoxonase 1，PON1）的基因多態(tài)性有關(guān)[6]。VEGF能增強(qiáng)毛細(xì)血管的細(xì)胞通透性，促進(jìn)血管增生，造成DM患者視網(wǎng)膜病變，而VEGF基因在轉(zhuǎn)錄過程中形成多種同分異構(gòu)體，如VEGF121、VEGF165和VEGF206，其表達(dá)活性受游離mRNA控制[7-9]。人體內(nèi)存在抗氧化和氧化機(jī)制，DM患者高血糖水平會(huì)促進(jìn)機(jī)體的氧化作用，打破機(jī)體抗氧化/氧化平衡，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，生成更多的氧化劑破壞機(jī)體細(xì)胞、組織和器官，引起病變。而PON1蛋白表達(dá)產(chǎn)物能抑制氧化應(yīng)激作用，當(dāng)機(jī)體PON1基因表達(dá)抑制，細(xì)胞過氧化加劇，細(xì)胞的代謝作用受到影響，引起病變，并且氧化應(yīng)激的正反饋?zhàn)饔脮?huì)進(jìn)一步加劇病變[10-11]。本研究以DM患者和體檢健康者為研究對(duì)象，探討VEGF、PON1基因多態(tài)性和DR的相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

表1 各組血壓及生化指標(biāo)水平比較

a：P<0.05，與NC組比較；b：P<0.05，與NPDR組比較

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年1月至2015年12月于西寧市第二人民醫(yī)院治療的DM患者168例，男97例，女71例。入選者相互無血緣關(guān)系，且符合DM判定標(biāo)準(zhǔn)：空腹?fàn)顟B(tài)下血糖水平，靜脈血漿大于7.5 mmol/L，靜脈全血大于6.4 mmol/L，毛細(xì)血管全血大于6.3 mmol/L；服糖后2 h血糖水平，靜脈血漿大于12.1 mmol/L，靜脈全血大于10.9 mmol/L，毛細(xì)血管全血大于11.8 mmol/L。排除心臟病、腎衰竭、肝癌等疾病患者。將患者分為3組：?jiǎn)为?dú)DM組（DM組）48例，男28例，女20例，平均（62.51±9.31）歲；PDR組66例，男34例，女32例，平均（61.73±8.75）歲；NPDR組54例，男30例，女24例，平均（63.28±9.65）歲。另選取同期體檢健康者104例納入健康組（NC組），男55例，女49例，平均（60.91±9.81）歲。本研究獲西寧市第二人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或近親屬簽署知情同意書。

1.2方法 測(cè)量并記錄所有受試者血壓、血脂及糖化血紅蛋白水平。采集受試者空腹靜脈血，提取基因組DNA后加入抗凝血清低溫保存待用，采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)超氧化物歧化酶（SOD）水平，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛（MDA）水平。PCR引物序列：PON1 Q192R，引物1：5′-TAT TGT TGC TGT GGG ACC TGA G-3′，引物2：5′-CAC GCT AAA CCC AAA TAC ATC TC-3′；PON1 L 55M，引物1：5′-GAA GAG TGA TGT ATA GCC CCA G-3′；引物2：5′-TTT ATT CCA GAG CTA ATG AAA GCC-3′。PCR反應(yīng)條件：先94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。

2 結(jié) 果

2.1各組血壓及生化指標(biāo)水平比較 與NC組比較，DM組、NPDR組及PDR組收縮壓、糖化血紅蛋白水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其他各項(xiàng)指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。PDR組和NPDR組收縮壓比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其余各項(xiàng)指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）,見表1。

2.2VEGF等位基因檢測(cè)結(jié)果 未發(fā)生基因突變時(shí)，C等位基因是純合型因子（CC），電泳結(jié)果呈現(xiàn)一條熒光帶（208 bp）；純合突變型等位基因（TT）電泳時(shí)產(chǎn)生122、86 bp兩條片段；雜合型（CT）電泳出現(xiàn)208、122、86 bp 3條片段。VEGF等位基因基因型檢測(cè)結(jié)果見圖1。

圖1 VEGF等位基因基因型檢測(cè)結(jié)果

2.3不同基因型患者DR發(fā)生率 CC基因型DR發(fā)生率71.05%，CT基因型發(fā)生率為56.27%，TT基因型發(fā)生率僅38.64%。CC基因型患者DR發(fā)生率明顯高于CT和TT基因型患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而CT基因型患者DR發(fā)生率與TT基因型患者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.4PON1等位基因檢測(cè)結(jié)果 PON1基因型PCR實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物有3種，分別為99、66、33 bp 3種片段。QQ基因型患者僅有99 bp片段，RR基因型有66、33 bp片段，QR基因型有99、66、33 bp片段。PON1 192位點(diǎn)基因型檢測(cè)電泳結(jié)果見圖2。

2.5不同PON1 192位點(diǎn)基因型受試者體內(nèi)SOD和MDA水平比較 PON1 192位點(diǎn)不同基因型體檢健康者SOD和MDA水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；PON1 192位點(diǎn)不同基因型DR患者SOD和MDA水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），QQ基因型患者體內(nèi)SOD水平低于其他兩種基因型患者，MDA水平高于其他兩種基因型患者，見表2。

表2 不同PON1 192位點(diǎn)基因型受試者體內(nèi)SOD和MDA水平比較

a:RR基因；b：QQ基因；c：QR基因；d：對(duì)比基因
圖2 PON1 192位點(diǎn)基因型檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

DM是一種由于胰島素分泌不足或胰島功能缺陷導(dǎo)致血糖過高的代謝性疾病，長(zhǎng)期高血糖會(huì)破壞各組織器官，眼、腎、血管的損傷尤為嚴(yán)重。DM對(duì)眼部損傷很大，可改變眼組織神經(jīng)和血管循環(huán)，損傷眼部功能和視力[12]。微血管是一類介于微小動(dòng)脈和微小靜脈的毛細(xì)血管網(wǎng)，為血液提供物質(zhì)交換和代謝的場(chǎng)所，而DM患者過高的血糖水平引起代謝紊亂，使血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而破壞視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞的聯(lián)合，研究表明DR是致盲的主要原因之一[13]。出血斑點(diǎn)、黃斑水腫、視網(wǎng)膜微血管異常和棉絨斑等癥狀都是視網(wǎng)膜血管病變的臨床表現(xiàn)，由視網(wǎng)膜微血管滲漏引起的缺血會(huì)使視網(wǎng)膜出血，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)脫落，嚴(yán)重?fù)p傷視力[14-15]。

DM患者體內(nèi)的高血糖環(huán)境會(huì)使蛋白激酶C的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)增多，這些轉(zhuǎn)錄因子作為分子信號(hào)促進(jìn)VEGF基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，使VEGF蛋白水平提升。另一方面，高血糖狀態(tài)會(huì)破壞毛細(xì)血管紅細(xì)胞的細(xì)胞膜組織成分從而使物質(zhì)交換速率變緩，細(xì)胞供氧不足而發(fā)生缺氧，發(fā)生正反饋?zhàn)饔茫龠M(jìn)VEGF蛋白表達(dá)。VEGF基因有3種基因型（CC、CT、TT），不同人體不同基因型的表達(dá)水平存在差異，基因突變對(duì)VEGF的表達(dá)產(chǎn)生影響。本研究表明，CC基因型患者DR發(fā)生率明顯高于CT和TT基因型患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但CT基因型患者DR發(fā)生率與TT基因型患者比較無明顯差異（P>0.05）。DR的發(fā)病率可能與CC和C等位基因頻率升高及VEGF基因的高水平呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，PON1基因多態(tài)性與DR關(guān)系密切，PON1基因有3種基因型（QQ、QR、RR）。PON1 192位點(diǎn)基因促進(jìn)DR發(fā)生但不影響DR的發(fā)展，PON1基因先通過控制PON1酶活性從而控制體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，氧化應(yīng)激是機(jī)體攝取氧分子進(jìn)行氧化反應(yīng)的過程，如視網(wǎng)膜中的不飽和脂肪酸參與氧化應(yīng)激。MDA水平可反映機(jī)體脂質(zhì)氧化程度，SOD可反映機(jī)體氧自由基水平。本研究通過SOD和MDA水平衡量氧化應(yīng)激水平，結(jié)果顯示，QQ基因型患者體內(nèi)SOD水平高于QR、RR基因型患者，MDA水平低于QR、RR基因型患者，說明QQ型患者體內(nèi)氧化應(yīng)激水平高。DR患者氧化應(yīng)激水平明顯高于健康體檢者。

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Correlationbetweenvascularendothelialgrowthfactorandparaoxonase1genepolymorphismwithdiabeticretinopathy*

WeiQinfeng1，LiXianjia2

（1.DepartmentofOphthalmology,SecondPeople′sHospitalofXiningCity,Xining,Qinghai810003,China； 2.DepartmentofTibetanMedicine,MedicalCollegeofQinghaiUniversity,Xining,Qinghai810003,China）

ObjectiveTo explore the correlations of vascular endothelial growth factor （VEGF） and paraoxonase 1 （PON1） gene polymorphism with diabetic retinopathy.MethodsA total of 168 patients with diabetes mellitus（DM） in the Second People′s Hospital of Xining City were selected from January 2013 to December 2015,and were divided into the DM group （48 cases）,proliferative diabetic retinopathy （PDR） group （66 cases） and non-proliferative diabetic retinopathy （NPDR） group （54 cases）.A total of 104 healthy subjects were selected as the control group （NC group）.The VEGF and PON1 gene polymorphisms were detected by using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism （PCR-RFLP）,and levels of superoxide dismutase （SOD） and malondialdehyde （MDA） of all subjects were detected by using UV spectrophotometer.ResultsCompared with the NC group,the systolic blood pressures and glycated hemoglobin levels in the DM group,NPDR group and PDR group were significantly increased,there were statistically significant differences （P<0.05）.No statistically significant difference was found in diastolic blood pressure and levels of cholesterol,triglyceride,high density lipoprotein among these groups （P>0.05）.There was statistically significant difference in systolic blood pressure between PDR group and NPDR group （P<0.05）,while no statistically significant difference was found in diastolic blood pressure and levels of cholesterol,triglyceride,high density lipoprotein and glycated hemoglobin between the two groups （P>0.05）.The incidence rate of DR in the patients with CC,CT and TT genotype was 71.05%,56.27% and 38.64%,respectively.The incidence rate of DR in the patients with CC genotype was significantly higher than that in the patients with CT or TT genotype （P<0.05）.No statistically significant difference was found in SOD and MDA levels of healthy subjects with different PON1 192 genotypes （P>0.05）.The SOD level of DR patients with QQ genotype was lower than that of patients with QR or RR genotype,and the MDA level of DR patients with QQ genotype was higher than that of patients with QR or RR genotype,the difference was statistically significant （P<0.05）.ConclusionThe expression of VEGF and PON1 genes could affect the development and progression of DR.PON1 gene might control the progression of DR by affecting the expression of oxidative kinase in DR patients.

vascular endothelial growth factor；paraoxonase 1；polymorphism，single nucleotide；diabetic retinopathy

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81560806）。

衛(wèi)欽鋒（1970-），副主任醫(yī)師，本科，主要從事眼科臨床研究。

R774.1

A

1671-8348（2017）30-4223-03

2017-04-18

2017-06-26）