牛磺膽酸對小鼠胸腺細胞凋亡影響的研究

郭鳳英　李培鋒　賈俊濤

摘要：為研究牛磺膽酸（TCA）對體外培養小鼠胸腺細胞凋亡的影響，探討其免疫調節作用，采用梯度離心法分離獲取小鼠胸腺細胞，37 ℃培養12 h后與不同濃度TCA共孵12 h。以流式細胞術對原代培養胸腺細胞早期凋亡進行定量檢測；應用分光光度法檢測了凋亡特異性蛋白酶Caspase-9、Caspase-3活性的變化。結果表明，TCA3組（終濃度為0.30 μg/mL）與胸腺細胞共孵12 h后，可極顯著抑制磷脂酰絲氨酸外翻，抑制細胞凋亡，TCA2組（終濃度為0.15 μg/mL）可顯著提高Caspase-9、Caspase-3活性，誘導細胞凋亡。說明TCA通過對體外培養小鼠胸腺細胞凋亡的調節作用來調節機體免疫功能。

關鍵詞：牛磺膽酸；細胞凋亡；免疫調節

中圖分類號：R965 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）19-3706-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.19.026

Abstract： In this paper the study was aimed at discussing the immunoregulation of taurocholic acid（TCA） by analyzing its effects on mice thymocyte apoptosis. The mice thymocyte cells were isolated by gradient centrifugation and cultured under 37 ℃ with TCA of different concentration for 12 hours. Through flow cytometry（FCM），the thymocyte apoptosis in early stage were detected quantitatively. Besides，the activity of caspase-9 and caspase-3 were detected through spectrophotometric methods. The results showed that the TCA group 3（the final concentration：0.3 μg/mL） could dramatically restrain phosphatidylserine from eversion and restrain the cells apoptosis. Meanwhile，TCA group 2（the final concentration：0.15 μg/mL） could greatly improve the activity of caspase-9 and caspase-3，and induce the cells apoptosis. It indicated that TCA adjusts organism immune function by regulating the mice thymocyte apoptosis.

Key words： taurocholic acid （TCA）； mice thymocyte apoptosis； immune regulation

膽汁在中國醫藥上的應用歷史悠久[1]。大量的藥理實驗表明，動物膽汁的主要藥理作用是由膽酸鹽和膽汁酸發揮的。牛磺膽酸（Taurocholic acid，TCA）是牛羊膽汁中的主要有效成分之一。研究表明TCA具有鎮咳、祛痰、平喘、抗炎作用，對心臟和血壓也具有一定的影響[2-4]。據報道[5]，TCA對機體免疫細胞功能具有調節作用。免疫細胞的凋亡在免疫系統的自穩中極為重要，已成為當今免疫學研究的一個熱點。本試驗采用流式細胞等技術，研究不同濃度TCA對原代培養小鼠胸腺細胞凋亡的影響，探討TCA對機體免疫功能的調節作用，從而為TCA的臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 清潔級純種昆明小白鼠，體重（20±2） g，雌雄各半，由內蒙古大學實驗動物研究中心提供。

1.1.2 藥品與試劑 牛磺膽酸，實驗室自制，純度達97%以上；淋巴細胞分離液，天津灝洋生物制品科技有限責任公司，批號LTS1077； Caspase-3分光光度法檢測試劑盒，南京凱基生物科技發展有限公司，貨號KGA-203；Caspase-9分光光度法檢測試劑盒，南京凱基生物科技發展有限公司，貨號KGA-403；Annexin V-EGFP細胞凋亡檢測試劑盒，南京凱基生物科技發展有限公司，貨號KGA-102。

1.1.3 主要儀器 酶標儀（ELX800，BIO-TEKINSTUMENTS）；超凈工作臺（FLC-3，哈爾濱東聯公司）；流式細胞儀（FACSCalibur，美國BD公司）；CO2培養箱（SERIE SⅡ，Forma Scientific，Inc.）。

1.1.4 數據處理 試驗結果采用x±s表示，用SAS 9.0軟件處理數據，兩樣本比較采用t檢驗，樣本組間差異比較采用F檢驗。

1.2 方法

1.2.1 胸腺細胞的獲取 眼球放血處死后，75%乙醇浸泡2 min，無菌分離胸腺，去除小血管及結締組織，置于4 ℃培養液（含RPMI-1640培養基，5%滅活小牛血清，谷氨酞胺2 mmol/L，青霉素100 U/mL，鏈霉素0.2 mg/mL）中，在250目篩網輕輕研磨，離心（1 500 r/min，4 min），洗滌2次，重懸細胞于含10%小牛血清的RPMI1640完全培養液中，計數并且調整細胞數至2×106個/mL，置于24孔細胞培養板并使每孔終體積為1 mL，于5% CO2孵育箱中37 ℃培養12 h。

1.2.2 試驗分組及處理 試驗動物隨機分為4組，每組5只，即空白對照組（胸腺細胞僅在完全培養基內培養）；TCA 1組（TCA終濃度為0.03 μg/mL，與胸腺細胞共同孵育12 h）；TCA2組（TCA終濃度為0.15 μg/mL，與胸腺細胞共同孵育12 h）；TCA3組（TCA終濃度為0.30 μg/mL，與胸腺細胞共同孵育12 h）。

1.2.3 胸腺細胞早期凋亡的檢測 采用流式細胞術Annexin V-PI雙染色法[6]，檢測TCA與胸腺細胞共孵育后凋亡早期磷脂酰絲氨酸外翻情況，進而反映細胞早期凋亡百分率。

1.2.4 Caspase-9的活化程度的檢測 按常規方法制備胸腺細胞。將培養得到的胸腺細胞用PBS洗滌二遍（2 000 r/min，離心5 min）。按照試劑盒要求進行操作。最后用酶標儀在405 nm處測定其吸光度[7]。

1.2.5 Caspase-3的活化程度的檢測 方法同1.2.4。

2 結果與分析

2.1 TCA對胸腺細胞早期凋亡的影響

由表1可見，不同濃度TCA與胸腺細胞共同孵育后，均能顯著抑制胸腺細胞凋亡（P<0.05），以TCA3組的抑制效果最好。

2.2 TCA對Caspase-9活化程度的影響

由表2可見，不同濃度TCA與胸腺細胞共同孵育后，TCA2組、TCA3組均可顯著誘導胸腺細胞凋亡（P<0.05），TCA1組則無明顯影響（P>0.05）。

2.3 TCA對Caspase-3活化程度的影響

由表3可見，不同濃度TCA與胸腺細胞共同孵育后，TCA2組可顯著誘導胸腺細胞凋亡（P<0.05），而TCA1、TCA3組則無明顯影響（P>0.05）。

3 小結與討論

研究發現，當細胞凋亡啟動之初，分布于細胞膜內側的磷脂酰絲氨酸（PS）暴露于細胞膜外，利用該特性可定量檢測早期凋亡細胞[8]。試驗結果顯示，高劑量TCA可顯著抑制胸腺細胞磷脂酰絲氨酸的外翻，顯著降低細胞凋亡百分率。由此表明，TCA抑制胸腺細胞磷脂酰絲氨酸外翻，阻止胸腺細胞的早期凋亡是通過其直接作用實現的。由于胸腺是T細胞分化、成熟的場所，在T細胞的分化和調節中起重要的作用[9，10]。因而提示，TCA可通過抑制胸腺細胞凋亡啟動階段，促進機體T細胞的應答反應，調節機體免疫。

Caspase是一類凋亡特異性蛋白酶，分為啟動Caspase（如Caspase-9）和效應Caspase（如Caspase-3）兩類，參與凋亡的啟動和執行過程，它們的活化是細胞凋亡過程中的關鍵[11]。活化的Caspase-9引發Caspase級聯反應，激活Caspase-3，其作為效應子，作用于不同的靶分子，經蛋白水解作用使細胞凋亡。試驗證實，TCA可顯著提高凋亡特異性蛋白酶Caspase-9、Caspase-3的活性，促進胸腺細胞凋亡。這一結果表明TCA誘導胸腺細胞凋亡，該作用可能與上調胸腺細胞中Caspase-9、Caspase-3的表達有關。

細胞凋亡（apotosis）在胚胎發育、組織發生、胸腺細胞的選擇等方面起著重要的作用。通過細胞凋亡機制的胸腺細胞陰性選擇，使大量未成熟的細胞包括自身反應性T細胞得到清除，從而保持正常免疫功能狀態。試驗結果顯示，在胸腺細胞發生凋亡早期時，TCA可抑制其發生凋亡，使胸腺細胞分化增殖，參與免疫反應。但隨著免疫反應進行到一定階段，也即胸腺細胞分化增殖到一定數量時，TCA 就開始誘導其凋亡，使免疫細胞維持在一定的數量水平而保證免疫反應有序地進行，從而使機體免疫系統保持穩態。由此可知，免疫細胞對早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞的反應是截然不同的。綜上所述，TCA通過對不同階段胸腺細胞凋亡產生誘導或抑制作用，調節機體的免疫反應。

參考文獻：

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