黑龍江省椴樹蜂蜜體外抑制金黃色葡萄球菌的實驗研究

熊亞敏，張偉濱，羅 洋，陳炳坤，吳文忠，姜 波，張錦明*

（1.哈爾濱醫科大學附屬第一醫學院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江省迎春林區人民醫院，黑龍江 雞西 158100）

黑龍江省椴樹蜂蜜體外抑制金黃色葡萄球菌的實驗研究

熊亞敏1，張偉濱1，羅 洋1，陳炳坤1，吳文忠2，姜 波1，張錦明1*

（1.哈爾濱醫科大學附屬第一醫學院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江省迎春林區人民醫院，黑龍江 雞西 158100）

目的研究黑龍江省不同地區椴樹蜜對金黃色葡萄球菌的體外抗菌作用。方法采用微孔板改良法復制金黃色葡萄球菌模型，將蜂蜜與無菌的培養基（Mueller-HintonBroth培養基）混合后得到5%～50%(w/v)的不同濃度，用不加蜂蜜的無菌培養基和麥盧卡蜂蜜作對照，測定蜂蜜的最低抑菌濃度（MIC）及最低殺菌濃度（MBC）。結果各品種蜂蜜均有抗菌性及殺菌性，但其抗菌及殺菌作用各有不同，其中以迎春椴樹黑蜂蜜（MIC為25%，MBC為25%）的抗菌作用較好，相當于麥盧卡15+，其余各類型椴樹蜜均具有不同程度的抗菌性作用。結論椴樹蜜對于金黃色葡萄球菌有抑菌性和殺菌性，不同地域的椴樹蜜對同一細菌具有不同的抗菌活性，其中以迎春地區黑蜂椴樹蜜為最佳，為開發和利用蜂蜜作為臨床抗菌藥物提供了一定的依據。

蜂蜜；最低抑菌濃度；最低殺菌濃度；金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌是人體皮膚和鼻腔的常見定植菌，同時也是引起臨床感染的常見致病菌，可引起如癤、癰、毛囊炎、甲溝炎等化膿性感染。近年來，由金黃色葡萄球菌所致醫院感染的發病率呈上升趨勢，其耐藥性也逐年增加，特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA），對β-內酰胺類及其他多種抗菌藥物耐藥，所導致的各種感染治療困難，病死率較高，因此逐漸引起臨床的重視[1]。作為最古老的甜味劑和健康食品，蜂蜜有很長的食用歷史。早在公元前5500年，在埃及/印度和中國的作品中就已提及蜂蜜常用于外敷傷口防治感染[2-3]，國內外開展的研究顯示蜂蜜對感染的治療效果顯著[3-5]。黑龍江省內蜂蜜資源眾多，是否存在抗菌性的差別也無相關研究。因此，本文旨在選取黑龍江省內不同地區椴樹蜂蜜對金黃色葡萄球菌的抑制作用進行研究，對比不同地區的椴樹蜜是否存在差別[3，6-7]。

1 材料與方法

1.1 一般資料

金黃色葡萄球菌ATCC25922為哈爾濱醫科大學附屬第一醫學院微生物科提供，將標準菌株接種于營養瓊脂平板上37℃、24 h進行復蘇傳代備用。取24 h細菌轉移至無菌的培養基(Mueller-HintonBroth培養基)，經麥氏比濁法調整菌液濃度為0.5麥氏（1×108cfu/mL），并用培養基稀釋200倍作為實驗濃度（5×105cfu/mL）。

1.2 蜂蜜樣本

使用的蜂蜜均為從蜂農手中購買的成熟蜂蜜，并在室溫下在黑暗中儲存，由蜂農根據地域區域和蜜蜂覓食地點（覓食半徑）的花卉鑒定品種，可包括蜂蜜A饒河椴樹黑蜂蜜、B迎春黑蜂椴樹蜜、C帽兒山椴樹蜜、D大青山椴樹蜜、E五大連池椴樹蜜、F五大連池拜泉椴樹、G尚志椴樹蜜、H賓縣椴樹蜜，為了確定我們研究的重現性和可靠性，對照組選擇麥盧卡蜂蜜（ComvitaWoundCare，NewZealand）：I麥盧卡15+、J麥盧卡20+。將給類型蜂蜜與無菌的培養基(Mueller-HintonBroth培養基)混合后得到5%、10%、15%、20%、25%、30%(w/v)的不同濃度。所有試管均為渦旋（DigisystemLaboratoryInstrumentsI nc.，臺灣），直到均勻混合。充分混合并通過0.2μm過濾過濾器（SartoriusAG，德國）于4℃冰箱保存備用。

1.3 最低抑菌濃度測定

根據參照文獻稍作改進[8-9]，將稀釋為各實驗濃度的蜂蜜溶液應用移液槍加入96孔板中190微升，空白組選擇無菌MHB培養基190微升，再向各組加入金黃色葡萄球菌菌液10微升，每組重復三遍，96孔板邊緣加培養基后，通過酶標儀檢測其600 nm處的數值記為T0，再置于振蕩器培養箱（Stuart，UK）以120 rpm，37℃保持24小時，取出測其600 nm處的數值記為T24。算出細菌的抑制率其公式為：抑制率=1-（實驗組T24-實驗組T0）/（空白組T24-空白組T0）×100%。

1.4 最低殺菌濃度測定

測定從MIC測試中沒有細菌生長的每種蜂蜜稀釋液。對于沒有細菌生長的每個蜂蜜濃度，選擇相應蜂蜜稀釋液的各孔，并將一個懸浮液從每個孔轉移到單獨的血瓊脂平板（PA板）上。將其均勻鋪展并在37℃下孵育24小時。MBC由允許小于1%的細菌生長的最小濃度確定。

2 結 果

2.1 MIC測定結果

不同蜂蜜的抗菌性差異明顯，蜂蜜A至蜂蜜J別依次在30%、25%、45%、45%、30%、30%、30%、40%、25%、20%及以上濃度的條件下抑制細菌的生長。因此，各蜂蜜對金黃色葡萄球菌的MIC可由此確定。見表1。

2.2 MBC測定結果

24小時后觀察血瓊脂平板，蜂蜜A至蜂蜜J別依次在40%、25%、50%、50%、40%、40%、40%、50%、25%、20%及以上濃度的條件下無細菌生長。因此，各蜂蜜對金黃色葡萄球菌的MBC可由此確定。見表1。

表1 黑龍江省內8種蜂蜜和2種麥盧卡蜂蜜對金葡菌的最低抑菌濃度（MIC）及最低殺菌濃度（MBC）

本研究結果顯示，不同產地的蜂蜜對同一細菌具有不同的抗菌活性，其中以麥盧卡20+蜂蜜的抗菌作用最好(MIC為20%，MBC為20%)，其次是麥盧卡15+和迎春椴樹黑蜂蜜(MIC為25%，MBC為25%)。而入選試驗的其他黑龍江省內蜂蜜品種的抗菌作用各有不同，饒河椴樹黑蜂蜜、五大連池椴樹蜜、五大連池拜泉椴樹抗菌性較其他蜂蜜省內稍好，MIC均為30%，MBC均為40%。而賓縣椴樹蜜的MIC稍差，均為40%，其中賓縣椴樹蜜的殺菌性（MBC）稍差（為50%），其余蜂蜜抗菌性均為45%。而帽兒山椴樹蜜、大青山椴樹蜜的抗菌性及抑菌性均稍差（MIC均為45%，MBC為50%）。本研究為體外抗菌敏感性試驗，其結果不一定適用于到臨床的應用，因為細菌生長環境的不同，以及細菌生物被膜在不同生長環境下導致組成結構的不同等其他因素都可以顯著影響蜂蜜的抗菌活性。

3 討 論

蜂蜜具多種藥理功能，其藥用價值的開發利用研究已有很長歷史。蜂蜜已被證明具有抗心律失常、抗動脈粥樣硬化、抗癌等作用，并可以有效的減少血小板聚集，增強免疫力，并對血管舒張活性有較強作用；此外還具有降壓、保護心臟、胃、肝臟等臨床價值，蜂蜜的具有抗菌作用與其高滲和含多種酚類化合物，具有較低的pH值等獨特的理化性質有關。再有，蜂蜜中含有起抗菌作用的過氧化氫類和非過氧化氫類物質，特別是過氧化氫(Hydrogenperoxide)，通過釋放自身的氧原子與病菌細胞中許多酶上的巰基(-SH)結合，使酶失活，干擾細菌的正常代謝，從而起到抗菌作用此外，有些蜂蜜特有的甲基乙二醛(Methylglyoxal，MGO)以及抗微生物肽蜂蜜防衛素-1等成分也是起到抗菌作用的一個原因[2，3，7，10]。

本研究就黑龍江省內多種椴樹蜂蜜對金黃色葡萄球菌的影響做初步探討，結果顯示黑蜂椴樹蜜在體外能有效抑制經黃色葡萄球菌的繁殖，甚至在25%（w/v）濃度時尚有明顯的殺菌性，這與麥盧卡15+的抗菌性相似，為開發和利用蜂蜜作為臨床抗菌藥物提供了一定的依據。但其具體機制還有待今后進一步的研究。盡管黑蜂椴樹蜜可以抑制細菌生長繁殖，但當中有效成分相對復雜，其干預作用很可能是多成分多途徑的綜合作用結果，目前的研究相對集中在體外實驗并不能完全模擬真實的體內作用過程，因此建立體內動物模型，對其進行全組分提取，定向分離，研究不同組分的藥效機制，尤其是信號轉導等，將成為研究的重點。另外研究結果還有待于進行臨床用藥試驗以確定療效，同時，隨著科學技術的不斷發展，對其化學組成、生物藥理效應、臨床各科應用等方面地深入研究，對醫學領域的新老課題進行多角度、立體研究，不斷豐富發展，這必將產生巨大的社會效益和經濟效益，從而為蜂蜜更廣泛的應用開辟了嶄新前景。

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Study on inhibition of Staphylococcus aureus in vitro of linden honey in Heilongjiang Province

XIONG Ya-min1， ZHANG Wei-bin1， LUO Yang1， CHEN Bing-kun1， WU Wen-zhong2， JIANG Bo1，ZHANG Jin-ming1*
(1.the First Af fi liated Hospital of Harbin Medical University，Heilongjiang Harbin，150001，China;2.Heilongjiang Province Yingchunlin area the People's Hospital，Heilongjiang Jixi 158100，China)

ObjectiveThe antibacterial effect of linden honey in different areas of Heilongjiang Province on Staphylococcus aureus in vitro.MethodsBy using the improved method of replication of Staphylococcus aureus model，honey and sterile culture medium (Mueller-Hinton Broth medium) mixed 5%～50%(w/v) of different concentrations，compared with sterile culture medium without honey and honey，the minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration MIC MBC determination of honey.ResultsAll kinds of honey are antibacterial and bactericidal，but its antibacterial and bactericidal effect are different，of which the spring ting tree black honey (MIC 25%，MBC 25%) of the antibacterial effect is better，the equivalent of medical grade honey Manuka UMF15 +，the rest of the various types of linden tree honey have different degrees of antibacterial effect.ConclusionLinden honey had antimicrobial properties and sterilization to Staphylococcus aureus，different regions have different antibacterial activity of linden honey on the same bacteria，of which spring area black linden honey bee is the best for the development and utilization of honey as clinical antibacterial drugs provided certain basis.

Honey; MIC; MBC; Staphylococcusaureus

R378.11

A

ISSN.2095-8242.2017.060.11688.04

國家臨床重點專科建設項目經費資助（2012-649）

張錦明，E-mail：yayamin0000@126.com

本文編輯：吳玲麗