VEGF及其受體在卵巢癌中的表達及臨床意義

李占巍　鄭杰　劉斐

【摘要】 目的 研究血管內皮生長因子（VEGF）及其受體在卵巢癌形成和轉化過程中的表達特點與卵巢癌的臨床病理學參數關系。方法 應用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）技術檢測39例卵巢癌及28例正常卵巢組織（正常對照）中VEGF、血管內皮生長因子受體1（VEGFR1）、血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）的mRNA表達的差異及臨床病理特征的相關性。結果 卵巢癌中VEGF、VEGFR1、VEGFR2的mRNA表述明顯高于正常卵巢組織， VEGF的mRNA表達差別倍數2-△△CT=1.34， 差異具有統計學意義 （P<0.05）；VEGFR1的mRNA表達差別倍數2-△△CT=3.11， 差異具有統計學意義 （P<0.01）；VEGFR2的mRNA表達差別倍數2-△△CT=2.34， 差異具有統計學意義（P<0.01）。

結論 VEGF、VEGFR1、VEGFR2的mRNA在卵巢癌組織中表達明顯增高， 提示VEGF及其受體可能與卵巢癌發生發展密切相關。

【關鍵詞】 卵巢癌；血管內皮生長因子；實時熒光定量聚合酶鏈反應

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.30.024

卵巢癌死亡率高， 嚴重威脅了婦女健康。由于無限制細胞增殖特性， 惡性腫瘤對于能量的需求是普通細胞的很多倍， 需要完善的供氧、供血體系， 血管的發生、成熟程度對腫瘤的生長、轉移的重要性不言而喻。其中在血管發育構成中， 受體酪氨酸激酶調控其生長、移植分化過程。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）及其受體的研究在眾多影響腫瘤血管生成的因子中最受人們的關注。VEGF在內皮細胞激活其受體從而促進血管和淋巴管網絡的擴展[1]。VEGF是通過其特異性受體血管內皮生長因子受體（VEGFR）介導， 發揮其促進新血管生成和提高血管通透性的生物學效應， 繼而在體內誘導血管新生[2]。本文旨在通過對正常人卵巢組織和卵巢癌組織中VEGF和VEGF表達特點的檢測， 進一步闡述腫瘤微血管生成機制與腫瘤侵襲轉移的

關系。

1 材料與方法

1. 1 實驗材料 組織材料選取2014年12月～2016年12月遼陽市第五人民醫院手術切除并未經治療且病理和臨床資料完整的卵巢癌組織標本39例， 28例正常卵巢組織（正常對照）。將采集好的樣本放入液氮速凍， 之后再轉入-70℃冰箱待用。所有診斷均經病理檢查證實。

1. 2 試劑 總RNA抽提試劑TRIZOL 美國Invitrogen公司（生產批號：15596-026）；RNAiso Plus Kit寶生物工程（大連）有限公司（生產批號：BK3303）；PrimeScript RT reagent Kit寶生物工程（大連）有限公司（批號：BK503）；SYBR Premix Ex Taq II Kit 寶生物工程（大連）有限公司（生產批號：BK402）；qRT-PCR儀德國JUIPITER儀器設備有限公司。

1. 3 研究方法 采用Trizol試劑盒提取癌組織以及癌旁組織總RNA， 反轉錄合成單鏈cDNA第一鏈合成， 利用按SYAR Drallex Bx CapⅡ試劑盒操作說明書制備qRT-PCR， 采用FOLD CHANGE方法對qRT-PCR的數據結果進行分析。本實驗以美國國家生物技術信息中心（NCBI）數據庫中基因為模板來設計所需用到的基因引物及內參基因， 運用QIUKE GENE設計軟件進行設計篩選而成。PCR引物及堿基序列：VEGF正向引物， 5'-CTCGCGGCTCTCCTCCATCTGT-3'， 反向引物：5'-TTGGCCTGCATTCACACTTGGTG-3'；VEGFR1正向引物：5'-AGATAGCCAGCGGCCTTTTGTGA-3'， 反向引物：5'-TGGCGGATCCATTAGCCTTCTG-3'；VEGFR2正向引物：5'-CAGGCGAATACCGCTGCTTCTAT-3'， 反向引物：5'-CGCGGTGCAGTTGAGTATGAGTC-3'。PCR反應條件如下：95℃， 30 s， 預變性40個循環；95℃， 5 s， 變性；55℃， 30 s， 退火；72℃， 30 s， 充分延伸， 采集熒光。β-actin 為內參。

1. 4 統計學方法 運用 Depression2.1軟件進行計算， 計算方法為2-△△CT法， 其中將對照組的2-△△CT 數值設為1。通過SPSS18.0軟件進行顯著性差異分析， P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 卵巢癌臨床特征 診斷時年齡36～75歲， 平均年齡61.28歲；家族史12例；腹水8例；周圍組織浸潤24例；淋巴結轉移22例。漿液性囊腺癌19例， 粘液性囊腺癌10例， 子宮內膜樣癌8例， 其他類型2例。卵巢癌組織分為三組：低分化（12例）、中分化（17例）、高分化（10例）， 按照國際婦產科聯合會（FIGO）分為4期， Ⅰ期3例， Ⅱ期6例， Ⅲ期22例， Ⅳ期8例。

2. 2 VEGF基因、VEGFR1基因和VEGFR2基因表達情況的測定 qRT-PCR擴增曲線均形態平滑， 復孔間平行性均好， 融解曲線均是單峰， 組間重復性均好。檢測結果經統計學分析后發現：與正常對照組織相比， VEGF的mRNA表達差別倍數2-△△CT=1.34， 差異具有統計學意義 （P<0.05）， 表明卵巢癌組織較正常組織VEGF基因表達水平發生了明顯上升；VEGFR1的mRNA表達差別倍數2-△△CT=3.11， 差異具有統計學意義（P<0.01）， 表明卵巢癌組織較正常組織VEGFR1基因表達水平發生了非常顯著的增高；VEGFR2的mRNA表達差別倍數2-△△CT=2.34， 差異具有統計學意義（P<0.01）， 表明卵巢癌組織較正常組織VEGFR2基因表達水平發生了非常顯著的增高。endprint

3 討論

實體瘤快速增長和轉移離不開血管生成， VEGF信號通路在血管的生成、功能完善、網絡構建的不同階段， 不同表達程度的VEGF受體及配體也都扮演著各自重要的角色。VEGF的生物學特性主要分為以下幾點：①引導血管內皮細胞的分裂并啟動體內形成血管；②具備明顯的腔化作用和增加血管通透性之作用；③有利于產生更多便于血管形成的組織因子；④具備免疫抑制作用[3]。VEGF特異性識別并結合VEGFR1后， 由于VEGFR1并不具有酪氨酸激酶結構域， 所以它缺乏細胞的信號轉導功能， 因而竟爭性地抑制VEGF的誘導形成新生血管[4]。近年來大量的研究表明， VEGF造成的內皮細胞的增殖、遷移、通透性以及存活等相關生理或病理生理的改變， 主要是通過特異性識別VEGFR2來實現的[5]。VEGFR2介導的最主要信號通路是PLC-γ-PKC-Raf-MEK-MAPK， 經此通路該通路可將信號有效的轉導至核內， 增強了相關內皮細胞增殖[6-8]。

本研究通過qRT-PCR法檢測卵巢癌組織和正常卵巢組織中VEGF和VEGFR表達， 發現卵巢癌組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 的mRNA表達量明顯高于正常卵巢組織， 這一結果表明VEGF在卵巢癌的發生和發展過程中起著重要作用， 深入研究VEGF和VEGFR的生物學特性， 有助于加深腫瘤微血管生成的分子機制及其發生發展的了解， 從而有助于人們在卵巢癌的診斷治療和預后判斷方面尋找新的途徑[9-11]。尤其是以此發現一種新型有效卵巢癌治療的方法， 即通過在抑制腫瘤血管生成的抗VEGF抗體、VEGF拮抗劑、反義VEGF血管生成抑制物的使用上取得突出的進展。

參考文獻

[1] Rak J. VEGF-D（ilated） lymphatics as gateways to metastasis. Cancer Cell， 2012， 21（2）：139-140.

[2] Kiselyov A， Balakin KV， Tkachenko SE. VEGF/VEGFR signalling as a target for inhibiting angiogenesis. Expert Opinion on Investigational Drugs， 2007， 16（1）：83.

[3] Colwell AS， Beanes SR， Soo C， et al. Increased angiogenesis and expression of vascular endothelial growth factor during scarless repair. Plastic & Reconstructive Surgery， 2005， 115（1）：204-212.

[4] Takahashi T， Ueno H， Shibuya M. VEGF activates protein kinase C-dependent， but Ras-independent Raf-MEK-MAP kinase pathway for DNA synthesis in primary endothelial cells. Oncogene， 1999， 18（13）：2221-2230.

[5] Lipson KL， Fonseca SG， Ishigaki S， et al. Lipson， K. L. et al. Regulation of insulin biosynthesis in pancreatic cells by an endoplasmic reticulum-resident protein kinase IRE1. Cell Metabolism， 2006， 4（3）：245-254.

[6] Krawczyk P， Matuszyk J. The mechanism of phospholipase C gamma 1 activation . Post?py Higieny I Medycyny Do?wiadczalnej， 2011（65）：

470-477.

[7] 汪叢敏， 李力， 李英惠， 等. VEGF、VEGFR在卵巢癌中的表達及其臨床意義. 腫瘤， 2006， 26（2）：196-198.

[8] 胡元晶， 曲芃芃. VEGF及其受體在上皮性卵巢癌中的表達及與血管生成的關系. 中國腫瘤臨床， 2006， 33（23）：1346-1349.

[9] 白鳳琴， 程國華. 血管內皮生長因子及其受體在上皮性卵巢癌中的表達及臨床意義. 臨床醫藥實踐， 2007， 16（10）：985-987.

[10] 李曉梅， 張友忠， 劉序會， 等. 上皮性卵巢腫瘤組織中VEGF及其受體的表達. 山東大學學報（醫學版）， 2001， 39（2）：152-154.

[11] 張西愿， 徐小博， 馬向東， 等. VEGF及其受體在上皮性卵巢癌組織中的表達及預后. 中國婦幼健康研究， 2014（6）：974-977.

[收稿日期：2017-08-04]endprint