轉錄組學研究群體感應系統在生物被膜中的獨特表達

李 帥，張魯濤，李海濤，王伯麗，史晶晶

(1.河北醫科大學第二醫院呼吸內一科，河北 石家莊 050000；2.石家莊信息工程職業學院，河北 石家莊 050035)

·論著·

轉錄組學研究群體感應系統在生物被膜中的獨特表達

李 帥1，張魯濤1，李海濤1，王伯麗1，史晶晶2

(1.河北醫科大學第二醫院呼吸內一科，河北 石家莊 050000；2.石家莊信息工程職業學院，河北 石家莊 050035)

目的研究群體感應系統基因簇在菌體生物被膜狀態的獨特表達。方法收集河北醫科大學第二醫院臨床檢驗科細菌室，分離培養的多重耐藥鮑曼不動桿菌；比較同一菌株在不同生長狀態，即快速生長期和生物被膜狀態下，群體感應系統基因簇的不同表達。結果同一菌體在快速生長期和生物被膜包埋期有著顯著不同的基因表達，表達差異基因最顯著的集中于菌體外膜蛋白的表達和細胞內通路的因子調控。菌株在生物被膜狀態下，表達差異的基因在生物被膜形成和形態維持過程中，起到了至關重要的作用。其中，群體感應系統基因簇是重要的調控因子之一。在細菌生物被膜狀態下，表達顯著升高。結論細菌生物被膜的形成，可以使鮑曼不動桿菌長期存活在生物或非生物的表面；在生物被膜中，細菌菌株得到持續的保護，造成了菌株耐藥性的增加和院內感染的反復發生。菌體生物被膜的生成和形態維持，其中很重要的調控因子是群體感應系統基因簇。它可能參與調控生物被膜內各個菌落間生物行為和聯系，使得生物被膜整體維持平衡。

鮑氏不動桿菌；抗藥性，多藥；生物被膜形成

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.11.001

鮑曼不動桿菌是一種革蘭陰性桿菌，其致病力強，常常引起廣泛而嚴重的院內感染。近年來，多重耐藥鮑曼不動桿菌越來越受到全世界臨床醫師的廣泛關注；究其原因，是由于其卓越廣泛的耐藥性和超強的形成細菌生物被膜的能力[1-2]。多重耐藥鮑曼不動桿菌難以治療，已經成為目前亟待解決的臨床難題；其對目前大多數抗生素治療均是耐藥的，造成了治療的極大困難。有研究表明，鮑曼不動桿菌的耐藥性，主要是由于菌體生物被膜的產生；過去曾認為特殊的耐藥基因或許并不是主要原因[3]。菌體生物被膜的形成，被認為是其致病力的重要特點；尤其是對于危重癥患者來說，細菌生物被膜的形成，可以使其長期存活在生物或非生物的表面；可以使其在不利的外環境下，在宿主的免疫攻擊下，仍可以長期存活[4]。細菌生物被膜，為菌體提供持續的保護，造成了菌株耐藥性的增加和院內的反復感染的發生。本研究通過轉錄組學研究，試圖揭示群體感應系統基因簇在生物被膜形成和維持過程中的表達變化?，F報告如下。

1 資 料 與 方 法

1.1 菌株篩選 試驗用菌株選自河北醫科大學第二醫院臨床檢驗科細菌室。篩選2016年我院多重耐藥鮑曼不動桿菌。將所有篩選菌株，再次進行藥物敏感檢測，剔除非鮑曼不動桿菌以及非多重耐藥菌株。多重耐藥菌株入選標準是所篩選菌株對所有抗生素有3種或3種以上耐藥。

1.2 菌株分型 采用重復序列聚合酶鏈反應(repetitive extragenic palindromic polymerase chain reaction，REP-PCR)方法將收集入選的菌株608株提取DNA，分析菌株亞型。在離心管中配置0.7麥氏濁度菌懸液，向菌體沉淀中加入溶菌酶，37 ℃處理45 min，再向管中加入蛋白酶K。70 ℃放置10 min，加入無水乙醇，反復洗滌，吸附，洗脫，得到菌株基因組DNA。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，退火溫度45 ℃，1 min循環35次，72 ℃延伸10 min。用凝膠成像系統觀察結果。

1.3 樣本制備 選取PCR分型數量最多優勢菌株第5亞型多重耐藥鮑曼不動桿菌株Acinetobacter baumannii BJAB0868，進行研究。制備2個不同生長狀態，即快速生長期和生物被膜狀態的樣本。

菌株用無菌肉湯配制成0.7麥氏比濁濃度菌液，37 ℃恒溫且持續搖晃的微量振蕩器上培養7～8 h，獲得快速生長期菌株，用酶標儀測定600 nm吸光度值(檢測OD600=0.4)。

菌株用無菌肉湯配制成0.7麥氏比濁濃度菌液，培養在50 mL微發酵罐內，持續培養在37 ℃恒溫無菌培養箱內，培養96 h。96 h后，用PBS液清洗3次，無菌環境中常溫風干，加入1%結晶紫2 mL，染色30 min。再用PBS反復清洗，95%乙醇，脫色15 min，用酶標儀測定600 nm吸光度值，為空白對照的2倍以上者為生物膜形成陽性。用電子顯微鏡觀察細菌生物被膜生長情況。選取生物被膜，應用細胞刮刀，輕輕刮下，懸浮于無菌肉湯中。

1.4 2個樣本RNA提取和高通量測序分析 比較同一菌株不同生長狀態，即快速生長期和生物被膜狀態，2個樣本轉錄組基因的表達。

取2個樣本0.7麥氏比濁濃度菌液200 μL，離心(3 500 r/min，10 min，37 ℃)，得到細菌混懸液。

分別提取上述2個樣本的細菌總RNA：應用RNAprotect Bacteria Reagent和RNeasy Mini Kit試劑盒，進行高通量測序分析；應用life-tech Ribominus系列試劑盒提取。將上述2個樣本進行mRNA的純化，再將純化后的樣本打斷，然后進行反轉錄、末端修復；之后進行PCR擴增。隨后，進行樣本的基因測序，高通量測序分析轉錄組基因的表達。測序基因序列比對至公共數據庫，進行基因功能注釋。

1.5 統計學方法 應用R version 3.3.0統計學軟件分析數據。兩個樣本間基因表達比較采用Fisher精確檢驗方法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 菌株亞型REP-PCR分型 所有菌株大體分為7個亞型，數量最多的優勢菌株為第5亞型多重耐藥鮑曼不動桿菌株Acinetobacter baumannii BJAB0868，見表1。

表1 多重耐藥鮑曼不動桿菌REP-PCR分類Table 1 The REP-PCR classification of multidrug resistance Acinetobacter baumannii

2.2 檢測基因質量評估 對檢測出的基因序列進行評估，用RSEM軟件評估轉錄組測序時對RNA的打斷是否隨機，若不隨機則可能對后續的分析產生較大偏倚。根據轉錄組基因序列的特點，轉錄組基因測序序列距離轉錄本的5′端和3′端越近，測序深度越低，但總體的均一化程度就會越高。統計學分析結果顯示，所測序的基因序列符合上述特點，判定為合格的轉錄組測序，可行進一步分析。橫坐標為距離轉錄本5′端的相對位置(以百分比表示)，縱坐標為覆蓋深度的平均值，可知本研究2個樣本基因測序序列符合正常RNA測序特點，為合格測序。見圖1。

圖1 2個樣本基因測序均一化分布曲線
Figure1Theuniformdistributioncurveoftwosamplegene

2.3 多重耐藥鮑曼不動桿菌不同狀態的轉錄組基因表達不同 同一菌株在2種不同的狀態下，生物被膜狀態與快速生長期的細菌相比，基因表達存在顯著差異。相對于快速生長期的細菌，生物被膜狀態下，有106個基因表達上調，92個基因表達下調。細菌的生物被膜狀態，不僅僅是細菌菌體的簡單堆疊，更是一種獨特的存在方式。

2.4 群體感應系統基因簇在生物被膜狀態顯著表達 鮑曼不動桿菌生物被膜的形成，一直以來被廣泛認為是細菌慢性感染和定植的首要原因。本研究發現同一菌體在快速生長期和生物被膜包埋期不同的基因表達，以至于會出現不同的蛋白質表達。表明處于生物被膜狀態的鮑曼不動桿菌處于獨特的生長狀態和蛋白質的表達。

調控因子在生物被膜形成和形態維持過程中，起到了至關重要的作用。其中，群體感應系統基因簇(quorum sensing,QS)是其中重要的調控因子之一。在細菌生物被膜狀態下，表達顯著升高，說明其可能與生物被膜生成和形態維持過程關系密切。見表2。

表2 群體感應系統基因簇在2種狀態表達差異Table 2 Quorum sensing expression in two states

3 討 論

過去認為菌體的生物被膜是一團菌落的組合、堆疊，不可逆地黏附于生物或非生物的表面。近期通過蛋白質組學分析以及轉錄組研究發現，生物被膜不單單只是細菌在不同生長階段的簡單混合物，而是一種特殊的生長期；不同于細菌的浮游狀態，有著自己獨特的蛋白質表型和基因表達[5]。在生物被膜中細菌菌株可以更加耐多種抗生素，耐干燥，耐各種環境的壓力，甚至耐紫外線的照射。細菌生物被膜為菌體提供持續的保護，造成了菌株耐藥性的增加和院內的反復感染。

細菌生物被膜的形成過程主要分為3個階段。開始是菌體初始黏附的形成，菌體會黏附于生物或非生物的表面。細菌的菌體與黏附表面之間，依靠相互的物理或化學作用，借助非特異性靜電引力、表面張力或疏水作用力等，相互黏附的過程。這個階段是可逆的[6]。隨后，進入聚集階段。這是細菌菌體與黏附表面之間的牢固結合的過程。聚集的菌落內菌體分泌大量的細胞外基質，黏附的表面與細菌菌體表面的外膜蛋白、菌毛等結構發生特異性的結合，使得整個生物被膜趨于成熟，這個階段黏附穩固而牢靠，黏附不再可逆[7]。細菌與黏附表面牢固而不可逆的結合后，生物被膜內的菌體會分泌大量的細胞外基質，包括細胞外多糖、細胞外遺傳物質等，使得整個生物被膜各個菌落趨于整體化；生物被膜成為動態穩固結構，會從外環境吸收有機或無機營養物質，維持整個被膜形態并不斷增長[8]。隨著生物被膜不斷增長，被膜內各菌落間以及菌落內的細菌間均會通過特定的信號通路，信號因子進行整體的調節，以適應生存和形態維持[9]。細菌菌體通過特定基因表達，表達不同信號因子，調控生物被膜動態穩定、內環境的平衡[10]。

在細菌生物被膜形成和形態維持過程中，各種特異調控基因均會發揮作用，很重要的一種是群體感應系統。QS介導細菌釋放特定信號因子，進行細菌菌體內部和菌落內菌體之間的信息交流，調控被膜內基因及蛋白表達的整體行為[11-13]。本研究通過轉錄組學基因表達分析發現，QS在生物被膜形成和維持過程中特異表達。菌體生物被膜的生成和形態維持，很重要的是依賴于QS的調控[14-15]。QS是一種菌落密度依賴性啟動表達。當菌體不斷黏附聚集，達到其密度依賴閾值就會顯著表達，激活相關轉錄調控因子。這些激活調控因子促使相關基因顯著表達，從而調控整個生物被膜協調菌落間生物行為，使得生物被膜整體維持平衡[16]。

總這，QS可介導細菌釋放特定信號因子，進行細菌菌體內部和菌落內菌體之間的信息交流，調控基因及蛋白表達的整體行為。抑制QS的表達會顯著減少菌體生物被膜生成的密度，還會降低鮑曼不動桿菌的致病力，使其較容易受到抗生素和宿主攻擊。本研究通過轉錄組學分析發現，QS在菌體生物被膜狀態下確實顯著表達。與上述觀點吻合。進一步研究抑制QS的治療，會為多耐藥鮑曼不動桿菌感染提供新的治療方向。

[1] Azizi O,Shahcheraghi F,Salimizand H,et al. Molecular analysis and expression of bap gene in biofilm forming multidrug resistant Acinetobacter baumannii[J]. Rep Biochem Mol Biol,2016,5(1):62-72.

[2] 孫靜娜，劉青松，劉澤世,等.多重耐藥及泛耐藥鮑曼不動桿菌外排泵基因adeB的研究[J].河北醫科大學學報，2014,35(10)：1166-1169.

[3] Lin MF,Lan CY. Antimicrobial resistance in Acinetobacter baumannii:from bench to bedside[J]. World J Clin Cases,2014,2(12):787-814.

[4] McConoughey SJ,Howlin R,Granger JF,et al. Biofilm in periprosthetic orthopedic infections[J]. Future Microbiol,2014,9(8):987-1007.

[5] Badave GK,Kulkarni D. Biofilm producing multidrug resistant Acinetobacter baumannii:an emerging challenge[J]. J Clin Diagn Res,2015,9(1):8-10.

[6] Thummeepak R,Kongthai P,Leungtongkam U,et al. Distribution of virulence genes involved in biofilm formation in multidrug resistant Acinetobacter baumannii clinical isolates[J]. Int Microbiol,2016,19(2):121-129.

[7] Duarte A,Ferreira S,Almeida S,et al. Clinical isolates of Acinetobacter baumannii from a Portuguese hospital:PFGE characterization,antibiotic susceptibility and biofilm-forming ability[J]. Comp Immunol Microbiol Infect Dis,2016,45:29-33.

[8] Inchai J,Liwsrisakun C,Theerakittikul T,et al. Risk factors of multidrug resistant,extensively drug-resistant and pandrug-resistant Acinetobacter baumannii ventilator-associated pneumonia in a Medical Intensive Care Unit of University Hospital in Thailand[J]. J Infect Chemother,2015,21(8):570-574.

[9] Liu Q,Li W,Du X,et al. Risk and prognostic factors for multidrug resistant Acinetobacter baumannii complex bacteremia:a retrospective study in a tertiary hospital of west China[J]. PLoS One,2015,10(6):e0130701.

[10] Qi L,Li H,Zhang C,et al. Relationship between antibiotic resistance,biofilm formation,and biofilm specific resistance in Acinetobacter baumannii[J]. Front Microbiol,2016,7:483.

[11] Smani Y,Fbrega A,Roca I,et al. Role of OmpA in the multidrug resistance phenotype of Acinetobacter baumannii[J]. Antimicrob Agents Chemother,2014,58(3):1806-1808.

[12] Zhang D,Xia J,Xu Y,et al. Biological features of biofilm forming abiliry of Acinetobacter baumannii strains derived from 121 elderly patients with hospital-acquired pneumonia[J]. Clin Exp Med,2016,16(1):73-80.

[13] Gala VC,John NR,Bhagwat AM,et al. Attenuation of quorum sensing regulated behavior by tinospora cordifolia extract & identification of its active constituents[J]. Indian J Med Res,2016,144(1):92-103.

[14] Kostoulias X,Murray GL,Cerqueira GM,et al. Impact of a cross kingdom signaling molecule of candida albicans on Acinetobacter baumannii physiology[J]. Antimicrob Agents Chemother,2015,60(1):161-167.

[15] Kandi V. Biofilm production correlating with multidrug resistance among clinical isolates of Acinetobacter baumannii[J]. J Clin Diagn Res,2015,9(6):DJ02.

[16] He X,Lu F,Yuan F,et al. Biofilm formation caused by clinical Acinetobacter baumannii isolates is associated with overexpression of the AdeFGH efflux pump[J]. Antimicrob Agents Chemother，2015，59(8):4817-4825.

Transcriptomestudyoftheuniqueexpressionofquorumsensinginbiofilmformation

LI Shuai1, ZHANG Lu-tao1, LI Hai-tao1, WANG Bo-li1, SHI Jing-jing2

(1.FirstDepartmentofRespiratoryMedicine,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China； 2.ShijiazhuangInformationEngineeringVocationalCollege,HebeiProvince,Shijiazhuang050035,China)

]ObjectiveTo study the unique expression of the quorum sensing in the bacteria biofilm formation.MethodsWe selected multidrug resistant Acinetobacter baumannii strains. Then we compared the two genomes in the rapid growth phase and biofilm state.ResultsIn the same cell, the expressions of genes in the rapid growth phase and biofilm stage were different. The most significant factors in the expression of genes were the outer membrane proteins and the regulation of intracellular pathways. In the biofilm state, these regulators played a crucial role in the formation and maintains. Among them, the quorum sensing was one of the most important regulatory factors. It was significantly increased in the biofilm state.ConclusionThe formation of bacteria biofilm could cause the long term survival of Acinetobacter baumannii. In the biofilm, the bacterial strain was continuously protected, resulting in increased resistance to the strain and repeated chronic infection in the hospital. The formation and morphology of the biofilm were relied on the regulation of quorum sensing. It may be involved in the regulation of biological behavior and contact among colonies in biofilms, so that the biofilm can be maintained as a whole.

Acinetobacter baumannii; drug resistance, multiple; bioflim formation

2017-04-07；

2017-05-25

河北省醫學科學研究重點課題(ZL20140206,20130503)

李帥(1981-)，女，河北石家莊人，河北醫科大學第二醫院副主任醫師，醫學碩士，從事呼吸疾病診治研究。

R378.79

A

1007-3205(2017)11-1241-04

(本文編輯：趙麗潔)