雞傳染性支氣管炎病毒廣東分離株S1基因的克隆與序列分析

盧秀嫻 張思遠 葉賀佳 梅廷媛/廣州市華南農大生物藥品有限公司

雞傳染性支氣管炎病毒廣東分離株S1基因的克隆與序列分析

盧秀嫻 張思遠 葉賀佳 梅廷媛/廣州市華南農大生物藥品有限公司

雞傳染性支氣管炎 （infectious bronchitis，IB）是由雞傳染性支氣管炎病毒 （infectious bronchitis virus）引起的一種急性、高度接觸性傳染病，主要影響呼吸系統、消化系統、泌尿生殖系統等。各種日齡的雞都會感染IBV，主要引起呼吸困難、腎炎、產蛋量和蛋品質的下降，IBV 還可侵害腎臟、腸道、腺胃、肌肉等組織，給養禽業帶來經濟上的損失。IBV自身有結構特殊性，并且RNA聚合酶具有不完善的糾錯機制能力，使得病毒基因組在復制的過程易突變和重組頻率增高，能夠產生許多血清型，目前已報道的血清型已有30多種，在我國主要以Mass，T，Gray 和 Holte 株等為主。

IBV基因組為線性單股正鏈RNA，全長約27.6 kb，編碼小膜蛋白（E）、膜蛋白（M）、核衣殼蛋白（N）和纖突蛋白（S）4 種主要結構蛋白。當S蛋白與宿主細胞膜上的病毒受體結合，并通過宿主細胞的蛋白酶裂解到S1和S2時，病毒包膜可與細胞膜結合，病毒纖突能表現出較強的特異性，S1基因是誘導和選擇性接受中和抗體的特異位點。S1可刺激中和和血凝抑制抗體，只有S1蛋白能誘導中和抗體，使機體起到有效地保護。雖然IBV的遺傳變異可以在基因組中的任何部分發生，但主要集中在病毒的S1基因。

S1蛋白是主要的感染性和致病性的病毒蛋白，其結構差異性導致了血清型的差異及變異株的存在，并且與IBV抗原性漂變和致病性的改變有關，并且還可以決定IBV血清型特異性抗原決定簇。S1蛋白的氨基酸序列之間的差異性有可能改變毒株之間的血清型，導致新的變異株出現，使其抗原性或免疫原性的改變。

本研究于2017年5月份在廣東省某疑似患雞傳染性支氣管炎的雞場病料被分離到1株IBV，并對IBV分離株 S1基因進行克隆、測序和序列基因遺傳變異分析。

一、材料與方法

1.病料來源、SPF雞胚及主要的試劑

病料樣品為2017年5月廣東某雞場疑似感染IBV雞的氣管、心臟、肝臟、腎臟等樣品；10日齡SPF雞胚購自梅里亞實驗動物中心；11日齡SPF雞胚購自梅里亞實驗動物中心； RNA提取試劑盒購自TaKaRa公司、DL2000 DNA Marker均購自北京全式金公司；2XPhanta PCR Master Mix購自諾唯贊生物公司；反轉錄試劑盒和核酸染料均購自TIANGEN公司，pMD20-T載體購自TaKaRa公司

2.引物設計與合成

根據Genbank中公布的IBV S1基因組序列，利用 Primer premier 6.0軟件及oligo6.0，針對IBV基因組S1基因的保守基因區間設計1對特異性檢測引物 IBS1(上 游 )：5'-TTCAGGTGGCGTTGATAC-3'(下 游 )：5'-AACCTTGGCCTACTCTGC-3'；根據 S1基因兩端外的保守序列設計1對擴增S1全長基因的引物，引物的理論跨幅為1722bp，可將S1 基因片段完全覆蓋，引物序列：S1P1(上游)：5'-TTGAAAACTGAACAAAAGA-3'，S1P2(下游 )：5'-CCATAACTAACATAAGGGCA-3'。由英濰捷基貿易有限公司合成引物。

3.病毒分離

采集臨床病料（主要是氣管肝臟、腎臟等組織），研碎后加入適量PBS，在-20℃和常溫條件下反復凍融3次，8000 r/min離心10 min，取上清液，加入雙抗（含200 U/ml 青霉素和200μg/ml鏈霉素）混合，作用2 h后，取0.2 ml接種于11日齡SPF雞胚的尿囊腔，放于37℃培養箱中孵育。36～48 h后收取雞胚的尿囊液，連續在SPF雞胚上盲傳3代。

4.IBV分離株RT-PCR鑒定和S1全長基因擴增

提取病毒的尿囊液中的RNA基因組，按照天根反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄。以合成的cDNA為模板，采用S1基因特異性檢測引物與S1基因全長引物分別進行PCR擴增，反應條件為：95℃預變性5 min；95℃變性30 S，54℃退火30S，72℃延伸2 min，35個循環；72℃延伸10 min。PCR反應結束后取產物以110V，50 mA電流進行電泳，結果約25 min后在凝膠成像系統紫外燈下觀察。

5.IBV分離株S1基因的克隆測序

按照膠回收試劑盒說明書，回收PCR擴增的IBV S1全長基因片段，將回收的PCR產物與pMD20-T克隆載體4℃連接過夜，轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，涂平板藍白斑篩選，挑去白色單菌落接種到 LB液體培養基中，于37℃恒溫培養振蕩器內震蕩培養12 h后，菌液經PCR鑒定后，呈陽性的被選送至英濰捷基貿易有限公司測序部進行基因全長序列的測定及拼接。

6.IBV分離株S1基因的序列分析

MEGA6.0分析軟件進行比較測定的S1基因序列，與參考株繪制遺傳進化樹。其中序列比對使用Clustal W多重比對方法，在進化樹繪制中選用Neighbor-Joining算法。

二、結果與分析

1.病毒的分離與鑒定

將病料進行處理與分離培養，利用針對IBV的S1基因特異性檢測引物和S1全長基因的引物，通過RTPCR對雞胚尿囊液進行擴增，結果能擴增出大小約為500 bp、1 722 bp的兩條預期目的片段，而陰性對照沒有擴增出條帶（圖1和圖2），表明該毒株為IBV，命名為CKGD/180/2017 。

2.S1基因序列分析

CK/GD/180/2017 S1基因全長1 620 bp(從起始密碼子ATG到S前體蛋白裂解位點)，編碼540個氨基酸，其裂解位點為RRFRR，與疫苗株 W93、D41的裂解識別位點相同。和50株國內外代表及常用疫苗株的S1基因序列進行了比較，同源相似性為64.7%～99.4%；與同一基因型的參考毒株CK/CH/HN/HN99等間相似性較高，為99.5%，與目前我國常用疫苗 Mass型的疫苗毒株相似性偏低，與 H120和H52之間的相似性僅80%～82.2%。

圖1 分離株S1基因te’xRT-PCR鑒定電泳圖

圖2 分離株S1全長基因RT-PCR擴增電泳圖

序列分析表明，與其他參考毒株相比，分離株CK/GD/180/2017的S1基因核苷酸序列存在大量的點突變， 還伴有堿基的插入、缺失現象，僅在少數區域相對保守，主要集中在19～25、116～120位氨基酸處變異。IBV中和抗體產生相關的抗原位點分別位于S1蛋白的第24～61、第132～149，第291～398處氨基酸。相關區域的抗原存在氨基酸突變、插入、缺失現象，這可能導致病毒抗原性和血清型的改變，并導致免疫失敗。

3 S1基因系統發育進化關系分析

圖3 IBV S1基因系統進化樹

將測定的分離株CK/GD/180/2017的核苷酸序列與參考毒株構建進化樹(結果見圖3)，結果發現包括標準毒株在內，所有毒株共分為9個基因型（LX4株、QXIBV株等組成I群；英國分離株4/91與UK/7/93組成基因II群；河南分離株 CK/HN/HN99 等組成基因III群；廣東分離株CK/CH/GD/ZJ10/2013、HN08株組成基因Ⅳ群、臺灣分離株 TW2575/98 和TW2296/95等組成V群；CK/CH/GX/NN11-4株等組成基因Ⅵ群； JASS株等組成的基因Ⅶ群，腎型分離株 ARK99 株、Holte 株等組成Gray型，疫苗株H120等代表的 Mass型），其中CKGD/180/2017屬于基因Ⅲ群，與H120代表的 Mass型疫苗株的親緣關系較遠。

三、討論

在本研究中，同一分支的參考毒株與CK/GD/180/2017屬于基因型Ⅲ群，其核苷酸序列和推導的氨基酸序列具有高度同源性，分別在91.9%～99.4%和93.9%～99..4%之間，裂解位點RRFRR，是否發生重組，是否因為基因的突變缺失插入現象，導致其毒力和致病性增強和組織嗜性發生改變，仍需進一步驗證。病毒中和抗體和血凝抑制抗體都是S1基因誘導產生，并介導病毒與宿主細胞結合，所以常用S1基因的遺傳進化關系、序列分析來研究IBV的流行趨勢。

目前廣東省內普遍使用的主要是Mass型H120和H52疫苗，但由于IBV基因組傳播過程中會導致多種基因型及血清型毒株的產生，如果地方流行毒株和疫苗毒株的血清型不一致，僅用單一或兩個血清型的疫苗，就不能有效的保護，不同血清型之間僅有部分或完全沒有交叉免疫保護，發病的情況仍然出現。因此此分離鑒定地方流行的血清型毒株，對其特性的研究來進行本地的防控。

（略）