EDTA抗原修復液用于促藍液的應用和體會

吳冬梅 陳小玲 陳永華 郭潤民

1.廣東醫科大學附屬醫院病理科，廣東湛江 524001；2.廣東醫科大學附屬醫院藥劑科，廣東湛江 524001；3. 廣東醫科大學附屬醫院心血管內科，廣東湛江 524001

EDTA抗原修復液用于促藍液的應用和體會

吳冬梅1陳小玲2陳永華1郭潤民3▲

1.廣東醫科大學附屬醫院病理科，廣東湛江 524001；2.廣東醫科大學附屬醫院藥劑科，廣東湛江 524001；3. 廣東醫科大學附屬醫院心血管內科，廣東湛江 524001

目的 探討EDTA抗原修復液是否可用做HE染色和免疫組織化學染色的促藍液。 方法 分別采用HE染色法及免疫組織化學染色對脫鈣后骨組織（10例）﹑冰凍脂肪組織（10例）﹑平滑肌組織（10例）﹑甲狀腺組織（10例）及腸癌組織進行染色（10例）。分別采用流水沖洗﹑43℃溫水﹑即用型PBS﹑pH=9.0 EDTA修復液作為促藍液進行藍化。 結果 在HE染色組的5種藍化方式中，以EDTA抗原修復液藍化2min（實驗時間為夏天）藍化最充分﹑效果最佳﹑不易脫片﹑層次分明﹑細胞核藍色鮮艷﹑核膜及染色質形態結構特點清楚﹑核漿對比度明顯；在免疫組織化學染色組，復染蘇木精后，經EDTA抗原修復液藍化2min，各組組織細胞核結構顯示清晰，能很好的襯托組化陽性信號。 結論 HE染色和免疫組織化學染色均可以將EDTA抗原修復液用于促藍液，且在免疫組織化學染色中，EDTA抗原修復液的效果與流水沖洗效果相當，而且節省了藍化的時間。

EDTA抗原修復液；促藍液；HE染色法；免疫組織化學染色

蘇木素-伊紅染色法（hematoxylin eosin staining，HE染色）中的顯藍，又稱返藍﹑促藍﹑藍化，蘇木素染色的組織切片經分化液分化后，其顏色由藍色變為紅色，再經弱堿性水溶液處理，使其由淺藍色變為藍色，蘇木素染色這一藍化過程是HE染色所必需的，藍化處理得當，細胞核才能呈現鮮艷的藍色，細胞核膜及染色質形態結構清楚，并且與伊紅的紅色形成鮮明的對比，紅藍相襯。HE染色切片的質量好壞不但取決予蘇木素﹑伊紅染液的質量﹑染色時間﹑染色溫度，而且在很大程度上還取決于染色過程中分化液﹑藍化液性質和類型的選擇，以及分色與藍化的時間[1-3]。在臨床工作中，一些前期處理好的切片，當以氨水藍化時會出現個別脫片情況，尤其是脫鈣后的骨組織﹑冷凍切片中的脂肪組織﹑平滑肌組織及甲狀腺等纖維或脂肪多的組織尤其顯著[4-5]。因此，本研究通過比較EDTA抗原修復液在HE染色和免疫組織化學染色促藍液應用比較，試圖找到快速而且穩定的藍化方法，從而提高HE染色和免疫組織化學染色的藍化速度。

表1 HE染色5種藍化所用時間（min）

1 材料與方法

1.1 材料

2016年1～6月廣東醫科大學附屬醫院病理中心的臨床標本中隨機挑取脫鈣后骨組織﹑冰凍脂肪組織﹑平滑肌組織﹑甲狀腺組織及腸癌組織各10例。本研究經廣東醫科大學附屬醫院倫理委員會審核批準，均獲得本研究所有患者的書面知情同意。

1.2 試劑

HE染色常用試劑，蘇木精﹑伊紅﹑二甲苯﹑乙醇﹑1%鹽酸乙醇，可調溫度的攤片機﹑pH為7.4～7.6的PBS溶液﹑pH=9.0 EDTA修復液。

1.3 方法

1.3.1 HE染色 （1）石蠟切片4um脫蠟至水；（2）蘇木精染色5～8min；（3）1%鹽酸乙醇分化數秒，水洗；（4）按表一所列方法對石蠟切片進行藍化處理，充分水洗；（5）0.5% 伊紅2～5min，水洗；（6）梯度乙醇脫水；（7）二甲苯透明；（8）中性樹膠封片.1.3.2 免疫組化染色 （1）石蠟切片常規脫蠟至水；（2）常規免疫組織化學染色到DAB顯色；（3）蘇木素復染，水洗干凈；（4）用pH 9.0抗原修復液藍化 2min；（5）梯度乙醇脫水；（6）二甲苯透明；（7）中性樹膠封片。

1.4 結果判定

顯微鏡下觀察，HE染色細胞核與細胞質染色染色對比是否清晰，顏色是否鮮艷。顯微鏡下觀察，免疫組化染色顯色后，細胞核染色是否深淺恰當，是否能清晰地顯示組織結構。

2 結果

2.1 HE染色采用5種藍化方式所用的時間

HE染色中分別采用流水沖洗﹑43℃溫水﹑即用型PBS﹑pH=9.0 EDTA修復液作為促藍液進行藍化，對應所耗時間具體結果見表1。可見EDTA抗原修復液不僅僅所用時間少，而且同一試劑可以多種用途。這樣，EDTA作為修復液使用后，可以繼續作為促藍液使用，在基層單位可以既節約成本又節省時間。

2.2 HE染色后藍化結果

HE染色采用5種藍化方式，以pH 9.0 EDTA溶液藍化2min（實驗時間為夏天）藍化最充分，效果最佳，不易脫片，層次分明，細胞核藍色鮮艷，核膜及染色質形態結構特點清楚，核漿對比度明顯，其他4種藍化方法相對于EDTA溶液藍化效果稍差。在實驗過程中各種組織經過5種藍化方法藍化后并未發現組織脫片。見圖1。

圖1 EDTA抗原修復液藍化HE染色甲狀腺組織

2.3 免疫組織化學染色藍化結果

免疫組織化學染色復染蘇木精后，經pH 9.0 EDTA溶液藍化2min后，各組組織細胞核結構顯示清晰，能很好的襯托組化陽性信號。本次實驗中，固定良好的組織在實驗過程中并未發現藍化后脫片。

3 討論

蘇木素伊紅染色（簡稱HE染色）和免疫組織化學染色是目前應用最廣泛的組織化學染色方法。在HE染色中，蘇木素染色后藍化得當是否也非常重要，如果藍化不足，染色偏弱，若藍化時間太長，又會加長染色時間。采用弱堿性水溶液盡管會很快使組織藍化，但是堿性水溶液會使細胞的PH發生改變，導致伊紅不容易上色。經過堿性水溶液藍化的切片，伊紅染色時間往往需要30～60s，甚至需要幾分鐘；而流水藍化的切片，伊紅染色時間只需要2～10s。長時間的伊紅染色會使伊紅吸附在細胞核上，形成核漿共染現象，使細胞核呈紫紅色，導致核漿染色對比不明顯，這在自動染色時特別明顯。自來水的pH為6～7，相對于鹽酸和蘇木精來說，都成弱堿性，組織在染色過程中，這種藍-紅-藍變色的現象，是蘇木紅和鋁離子所形成的藍色色淀的結合﹑解離和再結合的過程[6]。一般來說，藍色色淀在酸性環境中處于離子狀態，呈紅色，這種現象稱為色淀解離；相反，紅色離子狀態的色淀，在中性或堿性環境中處于結合狀態，呈藍色，這時就稱為色淀形成。有研究表明[7]，染蘇木精后在43℃溫水中既能達到快速藍化的目的，又不引起脫片。也有用PBS作為促藍液有很好效果[8]。當然更常用的是用流水沖洗藍化[9-10]。本實驗采用了幾種平常HE染色過程中較容易脫片的組織，實驗結果表明，當組織固定良好的情況下，pH 9.0的EDTA藍化并未出現脫片現象。并且無論HE染色或者免疫組化染色，用pH 9.0 EDTA（修復前或修復后）作為促藍液能達到很好的效果。能較好的和快速的使細胞核藍化，且在組織固定良好的情況下，未發現脫片現象；要注意的是，HE染色過程中，在用堿性促藍液進行藍化后必須用自來水充分沖洗，待完全沖去玻片中的促藍液后再繼續后續的伊紅染色。我們發現：EDTA抗原修復液可應用于HE染色和免疫組織化學染色的促藍液，且在免疫組織化學染色中，EDTA抗原修復液能快速達到藍化效果，這可能與其PH值﹑脫鈣等有關[11-16]。

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Application of EDTA antigen retrieval solution in blue solution of HE staining

WU Dongmei1CHEN Xiaoling2CHEN Yonghua1GUO Runmin3
1.Department of Pathology,Guangdong Medical University,Zhanjiang 524001,China;2.Department of Pharmacy,Guangdong Medical University,Zhanjiang 524001,China;3.Department of Cardiology,3.The Affiliated Hospital,Guangdong Medical University,Zhanjiang 524001，China

Objective To investigate whether EDTA antigen retrieval solution can be used for blue solution of HE staining and immunohistochemical staining. Methods Using HE staining and immunohistochemical staining of decalcified bone (10 cases),frozen adipose tissue (10 cases),muscle tissue (10 cases) and thyroid tissues (10 cases)and colorectal carcinoma tissues were stained (10 cases).Rinse with tap water,43 degree warm water and instant PBS respectively,pH=9.0 EDTA retrieval solution were used as blue solution. Results In HE staining groups,after blue staining using EDTA antigen retrieval solution for 2 min (experiments performed in summer),which effects were best,as evidenced by blue staining thoroughly，stripping off difficultly，more bright blue nuclei,more clear nuclear structure,significantly contrast between cytoplasm and nucleus.In immunohistochemical staining groups,after hematoxylin staining and blue staining using EDTA antigen retrieval solution for 2 min,the EDTA antigen retrieval solution made nucleus structure more clear,and immunohistochemical staining positive signals better. Conclusion EDTA antigen retrieval liquid can be used for blue solution of HE staining and immunohistochemical staining,EDTA antigen retrieval liquid have similar effects and expends less time compared with flush with streams.

EDTA antigen retrieval solution;Blue solution;HE staining;Immunohistochemical staining

R783.3

A < class="emphasis_bold"> [文章編號]]

] 2095-0616（2017）21-28-03

國家自然科學基金資助項目（81670348；81703762）；廣東省自然科學基金項目（2015A030310359；2016A030313678；2016A030310359）。

▲通訊作者

2017-09-15）