龍眼中性轉化酶基因(DlNI)的克隆及分析

帥 良，廖玲燕，韓冬梅，吳振先

(1.華南農業大學 園藝學院，廣東 廣州 510642；2.賀州學院 食品與生物工程學院/食品科學與工程技術研究院，廣西 賀州 542899；3.廣東省農業科學院 果樹研究所，廣東 廣州 510640)

龍眼中性轉化酶基因(DlNI)的克隆及分析

帥 良1,2，廖玲燕2，韓冬梅3*，吳振先1*

(1.華南農業大學 園藝學院，廣東 廣州 510642；2.賀州學院 食品與生物工程學院/食品科學與工程技術研究院，廣西 賀州 542899；3.廣東省農業科學院 果樹研究所，廣東 廣州 510640)

【目的】中性轉化酶是果實蔗糖代謝關鍵酶之一，克隆中性轉化酶基因對于揭示龍眼果實糖代謝具有重要的意義。【方法】以‘石硤’龍眼試材，采用RT-PCR結合RACE技術成功克隆了3個龍眼中性轉化酶基因全長cDNA序列。【結果】3個龍眼中性轉化酶基因全長cDNA序列分別命名為DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3，NCBI登錄號為KP769773、KP769774和KP769775，其中DlNI-1全長2090 bp，編碼589個氨基酸，比對結果發現與木薯(82 %)的中性轉化酶基因的氨基酸序列同源性最高；DlNI-2全長2558 bp，編碼709個氨基酸，比對結果發現與克萊門柚(80 %)的中性轉化酶基因的氨基酸序列同源性最高；DlNI-3全長2444 bp，編碼805個氨基酸，比對結果發現與克萊門柚(80 %)的中性轉化酶基因的氨基酸序列同源性最高。3個龍眼中性轉化酶基因的氨基酸序列都具有中性轉化酶的12個高度保守的結構域，并且都具有2個催化殘基，推測其蛋白都屬于α類，且都定位于細胞器中。3個基因在不同組織中表達量具有較大差異，其中DlNI-1和DlNI-2在葉片中都具有較高的表達量，而DlNI-3在果皮組織中具有最高的表達量。【結論】成功克隆了3個龍眼中性轉化酶基因，為后期深入研究中性轉化酶基因結構和功能奠定基礎。

龍眼；中性轉化酶；基因克隆；表達

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料為“石硤”龍眼(DimocarpuslonganLour.‘Shixia’)，采自廣東省農業科學院果樹研究所種質資源圃。組織特異性表達樣品分別使用“石硤”的根、莖、葉、花、幼果、成熟果實的果皮和果肉。其中根、莖、葉、幼果的采摘時間為龍眼果實謝花后30 d。

本實驗中所用的Amp、X-gal、IPTG、氯化鈉、氯化鈣、四硼酸鈉、硼酸、磷酸鈉、LB培養基等試劑購自上海生物工程有限公司；RNAOUT試劑盒購自北京華越洋生物科技有限公司；瓊脂糖、大腸桿菌感受態細胞、TaKaRa PCR Amplification kit、PMD 20-T Vector kit、TaKaRa 3’-Full RACE Core Set Ver.2.0和TaKaRa Gel DNA Purification Kit Ver2.0等購自TaKaRa公司；M-MLV逆轉錄酶購自美國Life公司；SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒購自Clontech公司；熒光定量試劑盒購自德國Roche公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA的合成 龍眼不同組織總RNA的提取采用RNAOUT試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書操作要求進行。去基因組DNA后，以總RNA為模板合成cDNA，反轉錄采用M-MLV (Life)，引物采用Oligo(dT)15Primer (TaKaRa)。cDNA的合成反應體系按照說明書要求進行。反應體系于PCR儀中進行如下反應程序：37 ℃ 80 min，70 ℃ 15 min。得到的cDNA于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 龍眼DlNI基因的中間片段克隆 依據GenBank上已經報道的其它物種的中性轉化酶基因序列，設計簡并引物P1和P2(表1)。以cDNA為模板進行PCR擴增，用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段，切膠，回收，連接轉化，測序。通過去載體分析所擴增的片段。

國家水資源監控能力建設。項目建設全面推進。積極開展三大監控體系建設，完成中央、流域、省級水資源監控管理三級信息平臺和水資源管理業務三級通用軟件開發；加強建設管理，完成制度體系建設；搭建技術框架，各地編制技術方案通過審查。

1.2.3 龍眼DlNI基因的3’-RACE克隆和5’-RACE克隆 根據所得到的片段序列，利用Primer Premier 5.0軟件，參照TaKaRa 3’-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒和Clontech SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit要求設計3’-RACE(P3、P4、P5、P6、P7、P8)和5’-RACE(P9、P10、P11)引物(表1)，嚴格按照說明書進行后續PCR擴增，目的基因片段回收、連接、轉化、鑒定、測序及結果分析同上。

1.2.4 龍眼DlNI基因全長的獲得及ORF驗證 將上述獲得的3’RACE和5’RACE結果序列和片段序列采用ContigExpress軟件進行拼接，獲得DlNI基因全長cDNA序列，通過使用NCBI的Blast和SIB的翻譯工具(Translate tool)(http://web.expasy.org/translate/)進行序列分析，找出基因全長序列的開放閱讀框(ORF)，設計ORF序列引物(P12和P13、P14和P15、P16和P17)，對ORF序列進行克隆，檢測，以確定所拼接的序列為正確的基因序列(表1)。

1.2.5 龍眼DlNI基因的生物信息學分析 使用NCBI上的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)工具查找基因的ORF；使用SIB(Swiss Institute of Bioinformatics)的(Translate tool)(http://web.expasy.org/translate/)對ORF進行翻譯；蛋白質分子量及理化性質分析采用ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)工具分析；使用NCBI上的Blastn和Blastx對序列進行比對分析；同源性及序列多重比較分析使用Clustal X 1.83軟件并用GeneDoc軟件進行美化編輯；運用MEGA 5軟件中的Neighbor-Joining(鄰位相連法，NJ)法構建系統進化樹并進行編輯。

表1 龍眼中性轉化酶基因克隆與表達分析中使用的引物

1.2.6 Real-time定量RT-PCR(RT-qPCR) 使用BatchPrimer3在線引物設計工具，進行RT-qPCR的引物序列設計(P18和P19、P20和P21、P22和P23、P24和P25、P26和P27)。RT-qPCR使用熒光染料為SYBR Green I Master(Roche)，儀器為Roche Lightcycler?480，使用384孔模塊。10 μl擴增體系：cDNA模板1 μl，5 μM的上游引物和下游引物各0.5 μl，SYBR Green I Master(Roche)5 μl，ddH2O 3 μl。使用DlActin和DlEF-1a基因作為雙內參進行RT-qPCR分析[19-20]。并用相對定量軟件對PCR結果的熔解曲線和標準曲線進行分析、定量。相對表達量計算采用2-△△CT法，由Roche Lightcycler?480軟件系統自動分析得出結果。

1.3 數據處理與作圖

使用Microsoft Office 2013軟件進行數據處理和分析，使用Origin 8.5作圖，并使用Adobe Illustrator CS6軟件進行圖形美化和編輯。

2 結果與分析

2.1 龍眼總RNA的提取

如圖1所示，圖中28S和18S兩條rRNA條帶完整清晰，且沒有明顯的拖帶現象，28S條帶比18S條帶要亮，說明RNA完整性較好，未發生降解。經測定提取的龍眼各組織混合總RNA的OD260/OD280比值均在1.8 ～ 2.0，OD260/OD230比值均高于2.0，說明提取的龍眼總RNA的質量較高，純度和完整性較好，可以用于基因克隆和熒光定量表達等后續分子生物學相關試驗。

圖1 龍眼總RNA的電泳圖Fig.1 Electrophoresis pattern of total RNA of longan

2.2 龍眼糖代謝相關基因的全長擴增

以龍眼不同組織混合cDNA為模板，使用P1和P2引物進行PCR擴增，得到一條長度為400 bp左右的片段(圖2A)，切膠，回收，連接，轉化后送測序。測序結果比對分析發現，本次擴增成功獲得了3條長度為363 bp的龍眼NI基因序列，分別命名為DlNI-1，DlNI-2和DlNI-3。

根據測序得到的DlNI-1、DlNI-2、DlNI-3基因片段序列，設計3’RACE(P3、P4、P5、P6、P7、P8)引物(表1)，按照TaKaRa 3’-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒內的PCR條件進行巢式PCR擴增，電泳檢測后均得到與目的片段相符的特異性片段，DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3的3’RACE第二輪擴增產物約600、700和600 bp(圖2B)，這些片段大小基本與預期相符合，切膠，回收，連接，轉化后送測序，測序結果分析表明，所獲得的3’末端序列與擴增的片段序列有相應的高度重復的片段，說明各基因的3’末端序列擴增成功。

根據測序得到的糖代謝相關基因片段DlNI-1、DlNI-2、DlNI-3的序列，設計5’RACE(P9、P10、P11)引物(表1)，按照Clontech SMARTTMRACE cDNAAmplification Kit試劑盒內PCR條件進行擴增，電泳檢測后均得到相應的與目的片段相符的特異性片段，DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3的5’RACE擴增產物約1500、1700和1700 bp左右(圖2C)，這些片段大小基本與預期相符合，切膠，回收，連接，轉化后送測序，測序結果分析表明，所獲得的5’末端序列與擴增的片段序列有相應的高度重復的片段，說明各基因的5’末端序列擴增成功。

M：DL2000；A：中間片段擴增結果；B：3’端片段擴增結果；C：5’端片段擴增結果；D：ORF序列擴增結果M: DL2000; A: Intermediate fragment; B: 3’ RACE result; C: 5’ RACE result; D: PCR product of ORF圖2 龍眼DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3基因序列擴增Fig.2 PCR product of DlNI-1, DlNI-2 and DlNI-3 gene from longan

根據擴增的糖代謝相關基因片段以及3’RACE和5’RACE結果，使用ContigExpress軟件對片段序列進行拼接，分別獲得各基因全長cDNA序列，再使用NCBI上的ORF Finder對序列ORF進行查找，根據ORF序列設計ORF全長(P12和P13、P14和P15、P16和P17)引物(表1)，驗證拼接全長序列的準確性，使用LATaq酶進行PCR擴增，經電泳檢測后均發現與預測片段大小相一致的條帶，DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3的ORF擴增產物約1900、2300和2100 bp左右(圖2D)，切膠，回收，連接，轉化后送測序，測序結果去載體后經Blast比對分析發現，各基因條帶的ORF序列都正確，結果表明成功獲得了DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3基因全長cDNA序列。

2.3 龍眼DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3基因的序列分析

圖3顯示，DlNI-1基因序列全長2090 bp，包括一個長度為96 bp的5’UTR和224 bp的3’UTR，ORF長度為1770 bp，編碼589個氨基酸，蛋白質的分子質量為66.40 kDa，等電點為6.18，蛋白質的不穩定系數為47.87，脂溶指數為89.61，其疏水性平均值為﹣0.187，表明該蛋白為親水不穩定脂溶蛋白，NCBI的登錄號為KP769773，經Blastn比對后發現與甜橙(XM_006471320.1和XM_006471319.1)和克萊門柚(XM_006424241.1)的NI基因核苷酸序列同源性最高，都高達89 %，BlastX比對結果顯示，與木薯(XP_007024490.1)、蓖麻(XP_002529075.1)和甜橙(XP_006471382.1)的NI基因推導的氨基酸序列同源性最高，分別為82 %，81 %和76 %。

DlNI-2基因序列全長2558 bp，包括一個長度為113 bp的5’UTR和315 bp的3’UTR，ORF長度為2130 bp，編碼709個氨基酸，蛋白質的分子質量為79.91 kDa，等電點為7.92，蛋白質的不穩定系數為38.03，脂溶指數為85.64，其疏水性平均值為﹣0.114，表明該蛋白為親水穩定脂溶蛋白，NCBI的登錄號為KP769774，經Blastn比對后發現與甜橙(XM_006472173.1)和克萊門柚(XM_006433502.1)的NI基因核苷酸序列同源性最高，都高達87 %，BlastX比對結果顯示，與克萊門柚(XP_006433565.1)和甜橙(XP_006472236.1、KDO81624.1)的NI基因推導的氨基酸序列同源性最高，都高達80 %。

DlNI-3基因序列全長2444 bp，包括一個長度為259 bp的5’UTR和148 bp的3’UTR，ORF長度為2037 bp，編碼678個氨基酸，蛋白質的分子質量為76.09 kDa，等電點為5.77，蛋白質的不穩定系數為35.94，脂溶指數為90.28，其疏水性平均值為-0.205，表明該蛋白為親水穩定脂溶蛋白，NCBI的登錄號為KP769775，經Blastn比對后發現與甜橙(XM_006488730.1)和克萊門柚(XM_006419242.1)的NI基因核苷酸序列同源性最高，都高達84 %，BlastX比對結果顯示，與克萊門柚(XP_006419305.1)和甜橙(XP_006488793.1)的NI基因推導的氨基酸序列同源性最高，都高達80 %。

下劃線表示保守區；箭頭表示催化殘基Underline indicate the motifs; Arrows show the catalytic residues圖3 眼DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3基因氨基酸序列比對Fig.3 Alignment of DlNI-1，DlNI-2 and DlNI-3 amino acid sequences

2.4 龍眼DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3基因的多序列比對及進化樹分析

龍眼DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3基因推導的氨基酸序列比對結果表明，DlNI-1的氨基酸序列與DlNI-2和DlNI-3的氨基酸序列一致性為74 %和65 %，DlNI-2的氨基酸序列與DlNI-3的氨基酸序列一致性為68 %，同時這3個基因的氨基酸序列都具有中性轉化酶的12個高度保守的結構域，并且都具有兩個催化殘基[21]。

為進一步分析龍眼中性轉化酶氨基酸序列的進化關系，本試驗從擬南芥中挑選At1g22650、At1g35580、At1g56560、At1g72000、At3g05820、AT3G06500、At4g09510、AT4G34860和At5g22510共9個中性轉化酶氨基酸序列[22]，從水稻中挑選BAH00142、BAH00419、BAG89564和BAG95698 4個中性轉化酶氨基酸序列[21, 23]，和龍眼DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3基因的氨基酸序列構建進化樹。

由進化樹結果可知，中性轉化酶可以明顯的分為α和β兩大類[13, 21]，其中α類的中性轉化酶主要定位于細胞器中，而β類的中性轉化酶則定位于非細胞器中，而α類又可以分為兩大類，一類定位于線粒體中，另一類則在定位于質體中[23]。本試驗克隆的3個龍眼中性轉化酶蛋白推測都屬于α類，即都定位于細胞器中，其中龍眼DlNI-1與擬南芥At5g22510的進化關系較近，可能定位于質體中，而DlNI-2和DlNI-3分別與At1g56560和AT3G06500進化關系較近，可能定位于線粒體中(圖4)。

2.5 龍眼DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3基因的不同組織特異性表達分析

龍眼不同組織中DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3基因的表達量相差較大，DlNI-1基因在葉片中具有最大的表達量，其次為花、幼果、根、果皮和果肉，表達量最小的為莖中(圖5 A)；DlNI-2基因在葉片中具有最大的表達量，其次為花、果皮、幼果、根和莖，表達量最小的為果肉中(圖5 B)；DlNI-3基因在果皮中具有最大的表達量，其次為葉片、根、花和幼果中，而在果肉中表達量較低，在莖中幾乎不表達(圖5 C)。由此可知DlNI-1和DlNI-2基因可能在調節葉片組織中蔗糖含量的高低起作用，而DlNI-3基因在果皮組織中起調節果皮蔗糖含量。

圖4 龍眼DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3系統進化樹分析Fig.4 Phylogenetic analysis of DlNI-1, DlNI-2 and DlNI-3 and other plant NI amino acid sequences

圖5 龍眼DlNI-1(A)、DlNI-2(B)和DlNI-3(C)基因在不同組織中的表達Fig.5 DlNI-1 (A), DlNI-2 (B) and DlNI-3 (C) gene expression in different tissues of longan

3 討論與結論

中性轉化酶最基本的功能是分解蔗糖成為葡萄糖和果糖，相比于在酸性轉化酶上的研究成果，目前對中性轉化酶的功能了解還較少，主要原因是因為中性轉化酶蛋白具有不穩定性和低活性的特點[5, 24]。隨著近年來對其研究的深入，發現中性轉化酶在影響擬南芥側根生長，百脈根花粉形成及開花的過程中起主要作用[25-26]。通過RT-PCR結合RACE技術成功克隆了3個龍眼中性轉化酶基因全長cDNA序列，分別命名為DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3，NCBI登錄號為KP769773、KP769774和KP769775。其中DlNI-1全長2090 bp，編碼589個氨基酸，氨基酸序列比對結果發現與木薯和蓖麻的中性轉化酶基因的氨基酸序列同源性最高；DlNI-2全長2558 bp，編碼709個氨基酸，氨基酸序列比對結果發現與甜橙和克萊門柚的中性轉化酶基因的氨基酸序列同源性最高；DlNI-3全長2444 bp，編碼805個氨基酸，氨基酸序列比對結果發現與甜橙和克萊門柚的中性轉化酶基因的氨基酸序列同源性最高。同源性比對發現，3個中性轉化酶基因都具有12個中性/堿性轉化酶所特有的保守域，這些保守域具體功能還不是很清楚[21, 24]，進化樹結果表明，所有的中性轉化酶基因可以分類α和β兩大類[13, 21]，其中α類的中性轉化酶主要定位于細胞器中，而β類的中性轉化酶則在非細胞器中，其中α類又可以分為兩大類，一類在定位于線粒體中，而另一類則定位于質體中[23]。分析發現龍眼DlNI-1可能定位于質體中，而DlNI-2和DlNI-3分別可能定位于線粒體中。不同組織特異性表達結果顯示，DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3 3個基因在不同組織中表達量具有較大差異，其中DlNI-1和DlNI-2在葉片中都具有較高的表達量，這與在番茄[14]和大豆[27]中對中性轉化酶的研究結果一致。DlNI-1和DlNI-2在花中的表達量也較高，可能是由于植物進入生殖生長時期，庫器官生長發育，不斷催化蔗糖水解為葡萄糖和果糖，對能量物質需求過大所導致。而DlNI-3在果皮組織中具有最高的表達量，其次為根、葉片中，而在莖中幾乎不表達，由此可知DlNI-3在龍眼根生長中不起作用，而在調節龍眼果皮中碳水化合物含量多少起主要作用。

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CloningandSequenceAnalysisofNeutralInvertaseGene(DlNI)fromLonganFruit

SHUAI Liang1,2, LIAO Ling-yan2, HAN Dong-mei3*, WU Zhen-xian1*

(1.College of Horticulture, South China Agricultural University, Guangdong Guangzhou 510642, China; 2.College of Food and Biological Engineering/Institute of Food Science and Engineering Technology, Hezhou University, Guangxi Hezhou 542899, China; 3.Institute of Fruit Tree Research, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangdong Guangzhou 510640, China)

【Objective】Neutral invertase was a key enzyme of fruit sucrose metabolism, and cloning neutral invertase gene sequences had a significance for sugar metabolism. 【Method】TakenDimocarpuslongan‘Shixia’ cultivar as tested materials, the whole lengths of its three neutral invertase gene cDNA were cloned and sequenced by RT-PCR and RACE. 【Result】Three neutral invertase gene cDNAs named asDlNI-1,DlNI-2 andDlNI-3, the NCBI numbers were KP769773, KP769774 and KP769775, of which theDlNI-1 gene consisted of 2090 bp encoding a polypeptide of 589 amino acids, which had the highest homology with theManihotesculentacrantz(82 %) through the NCBI blastx; TheDlNI-2 gene consists of 2558 bp encoding a polypeptide of 709 amino acids, which had the highest homology with theCitrusclementina(80 %) through the NCBI blastx; TheDlNI-3 gene consists of 2444 bp encoding a polypeptide of 805 amino acids, which had the highest homology with theCitrusclementine(80 %) through the NCBI blastx. Amino acids of three longan neutral invertase gene sequence had 12 highly conservative domain structure and two catalytic residues, it was concluded that the three neutral invertase protein belonged to α class and located in organelles. The expression level of three neutral invertase genes had bigger difference in different tissues, theDlNI-1 andDlNI-2 had the highest expression level in leaves, but theDlNI-3 had the highest expression in pericarp. 【Conclusion】Three longan neutral invertase gene were cloned, which would provide references for the investigation of the relation between structure and function of neutral invertase gene.

Dimocarpuslongan; Neutral invertase; Gene cloning; Expression

1001-4829(2017)10-2202-08

10.16213/j.cnki.scjas.2017.10.008

2016-07-20

國家現代農業產業技術體系(荔枝龍眼CARS-33-14)資助；廣東省揚帆計劃項目(2014YT02H013)

帥 良(1986-)，男，江西新干人，博士，研究方向：農產品貯藏保鮮，E-mail:shuailiang1212@163.com；*為通訊作者：韓冬梅，E-mail: handm2009@qq.com；吳振先，E-mail:litchi2008@126.com。

S667.2

A

(責任編輯 陳 虹)