H3K27三甲基化在肺癌中的表達及臨床意義

張積廣　葉明凡

【摘要】 目的：探討組蛋白H3K27三甲基化（H3K27me3）在肺癌中的表達及其臨床意義。方法：收集筆者所在科2006年3月-2016年8月75例肺癌患者的病灶組織及其周圍正常肺組織，采用組織陣列檢測（TMA）技術檢測組蛋白H3K27me3在肺癌組織及周圍正常肺組織中的表達，采用免疫反應積分法（IRS）進行評估和比較。結果：肺癌組織的平均IRS得分為（4.40±1.63）分，顯著高于正常組織的（0.74±0.28）分，差異有統計學意義（P<0.05）；H3K27me3蛋白的高表達與淋巴結轉移、中-低分化肺癌和未分化肺癌、TNM分期Ⅱ～Ⅲ期有關，差異均有統計學意義（P<0.05），與性別、年齡、吸煙史、腫瘤直徑、組織類型等無關，差異均無統計學意義（P>0.05）。結論：肺癌H3K27me3可能與肺癌的發生、發展及轉移有關，臨床上對H3K27me3表達水平進行檢測，可能對疾病的發展、預后具有重要意義。

【關鍵詞】 肺癌； H3K27三甲基化； 臨床

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.20.017 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2017）20-0040-02

表觀遺傳學是指DNA序列不發生變化，但基因表達卻發生了可遺傳的改變，而表觀遺傳修飾主要包括DNA甲基化、組蛋白乙酰化和甲基化等[1]。組蛋白甲基化修飾在基因表達和染色體結構調節上發揮關鍵作用，通過影響染色體結構“開放”或“關閉”，控制基因轉錄的激活或抑制[2]。組蛋白H3的N-末端賴氨酸殘基K27（H3K27）是主要的甲基化修飾位點之一，在體內有單甲基化（mel）、二甲基化（me2）及三甲基化（me3）形式[3]，其甲基化程度可影響相應區域DNA的轉錄活性，從而發揮轉錄抑制作用[4]。本研究通過組織陣列檢測（TMA）技術檢測全基因組蛋白H3K27三甲基化（H3K27me3）在肺癌組織中的表達及其臨床意義，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2006年3月-2016年8月筆者所在科收治的成人肺癌病灶組織及其周圍正常肺組織（距離癌腫>5 cm），各75例，患者男51例，女24例，年齡37～78歲，平均（62.8±6.3）歲。所有患者術前均未進行放療、化療或免疫治療，所有病例術后病例診斷報告均顯示為原發性肺癌，其中鱗狀細胞癌37例，腺癌29例，大細胞癌6例，小細胞癌3例；其中高分化肺癌24例，中-低分化肺癌46例，未分化肺癌5例；發生淋巴結轉移39例，無淋巴結轉移36例；TNMⅠ期25例，Ⅱ期19例，Ⅲ期31例。

1.2 方法

檢測組蛋白H3K27me3的表達，具體如下：（1）構建肺癌TMA，在光學顯微鏡下標記標本無壞死或退變、有肺癌代表性的區域，用打孔針（直徑1.5 mm）于Quick-Ray預鑄受體蠟塊（韓國UNITMA公司）上打孔后即可取出2份圓柱形組織，分別將兩塊組織放入2個受體蠟塊進行對比，60塊組織/蠟塊方陣，共5個TMA模塊。將組織蠟塊方陣置于52 ℃恒溫烤箱內加熱1 h，室溫冷卻30 min，然后置于-20 ℃冷卻6 min。采用全自動輪轉式切片機（型號：Leica RM2255，由德國Leica公司生產）切片，厚度為4 μm。將切片置于45 ℃溫水，切片充分舒展后采用組織芯片載玻片（上海桑戈生物科技有限公司）將切片撈起、室溫中晾干，置于95 ℃攤烤片機內烤干后，調至60 ℃烤16 h，室溫冷卻后放在-20 ℃冰箱內備用；（2）免疫組織化學方法染色，將切片置于60 ℃溫箱內孵育30 min，用二甲苯脫蠟、梯度濃度酒精水化后，置于高壓蒸汽中加熱抗原修復，然后用0.3%甲醛/H2O2對內源性過氧化物酶進行封閉。加入羊血清，常溫孵育1 h后，加入H3K27me3兔抗人多克隆抗體（1∶200）（美國Cell Singnaling Technology公司生產），置于4 ℃冰箱內過夜。切片加入HRP標記山羊抗兔IgG抗體后孵育1 h，置于4 ℃冰箱30 min，再置于DAB溶液中10 min，梯度濃度酒精脫水后置于二甲苯中透明，蓋上玻片后用中性樹脂封片，待晾干即可觀察；（3）結果的判讀，所有切片均經本院病理科2位臨床病理醫師對切片HE染色及免疫組化染色進行獨立閱片。

1.3 觀察指標及評價標準

采用免疫反應積分法（IRS）：（1）染色強度的積分，以胞漿或胞核內棕黃色顆粒為陽性標準，分為：①棕褐色顆粒為強陽性，3分；②棕黃色顆粒為陽性，2分；③淡黃色顆粒為弱陽性，1分；④無著色為陰性，0分；（2）陽性細胞百分比積分，計數5個高倍鏡視野內細胞中的陽性細胞百分比：①>75%，4分；②51%～75%，3分；③26%～50%，2分；④0～25%，1分；IRS得分=染色強度積分×陽性細胞百分比積分，每個病例得分取兩個重復樣本之均值[5]。

1.4 統計學處理

本研究數據采用SPSS 17.0統計學軟件進行分析和處理，計量資料以（x±s）表示，正態計量資料組間比較采用t檢驗，組間多重比較采用LSD-t檢驗，計數資料以率（%）表示，采用字2檢驗，，P<0.05視為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺癌組織與正常肺組織內組蛋白H3K27me3表達水平比較

肺癌組織的平均IRS得分顯著高于正常組織，差異有統計學意義（P<0.05）

2.2 組蛋白H3K27me3的表達與肺癌臨床病理因素的關系

H3K27me3蛋白的高表達與淋巴結轉移、中-低分化肺癌和未分化肺癌、TNM分期Ⅱ～Ⅲ期有關，差異均有統計學意義（P<0.05），與性別、年齡、吸煙史、腫瘤直徑、組織類型等無關，差異均無統計學意義（P>0.05）

3 討論

國家癌癥中心2015年發布的數據顯示，2006-2011年我國肺癌5年患病率是130.2（1/10萬），在男性惡性腫瘤中居第2位，在女性惡性腫瘤中居第4位[6]。盡管肺癌的治療取得了進步，死亡仍是絕大多數肺癌患者的最終結局，因此，要發展更有效的肺癌診療方法，研究腫瘤形成的分子機制是至關重要的課題[7]。endprint

越來越多研究顯示，表觀遺傳學可通過自分泌循環通路、原癌基因和抑癌基因這三個因素的調控影響肺癌的發生、發展[8]。組蛋白是染色質的基本組成單位，而組蛋白尾部的某些氨基酸殘基發生的翻譯后修飾可改變染色質結果，從而影響基因表達[9]。組蛋白的修飾方式主要有甲基化、乙酰化和磷酸化。組蛋白H3的N-末端賴氨酸殘基K27（H3K27）是主要的甲基化修飾位點之一，其甲基化是一個抑制基因轉錄的關鍵介質，能引發重要的生物學功能[10]。文獻[4]報道，H3K27me3在肝細胞癌、膀胱癌中高表達，預示預后差，而在胰腺癌和婦科惡性腫瘤中預后良好，提示H3K27在不同腫瘤中與特定基因關聯，通過甲基化調控特定抑癌基因和原癌基因活性，從而影響疾病的臨床預后。本研究采用組織陣列檢測（TMA）技術對75例肺癌病理標本及癌旁正常肺組織進行組蛋白H2K27me3檢測，通過免疫反應積分法（IRS）綜合考慮病理組織的染色強度和陽性細胞百分比這兩個因素。結果顯示，肺癌病理組織內的組蛋白H2K27me3表達水平顯著高于正常組織，差異有統計學意義（P<0.05），且組蛋白H2K27me3的表達與淋巴結轉移、中-低分化肺癌和未分化肺癌、TNM分期Ⅱ～Ⅲ期有關，差異有統計學意義（P<0.05），表明組蛋白H2K27me3的高表達與肺癌的發展、轉移關系密切。其機制可能是組蛋白H3K27me3抑制抑癌基因的轉錄[11]，影響細胞周期的調控，從而使得抑癌基因沉默，最終影響腫瘤的發生、發展及預后。

綜上所述，肺癌細胞內組蛋白H2K27m3高表達可能與疾病的發生、發展關系密切，臨床上對其進行檢測，可能對疾病的發展、治療、預后判斷具有重要臨床意義。

參考文獻

[1]劉勇，張領，賈二騰，等.未成熟卵母細胞的形態與成熟能力、染色質構型和H3K27三甲基化水平的相關性研究[J].中國細胞生物學學報，2014，36（11）：1484-1490.

[2]唐善浩，裴仁治，馬俊霞，等.組蛋白H3K27甲基化抑制劑EPZ005687對U937細胞和正常骨髓CD34+細胞凋亡、增殖及細胞周期的影響[J].中國實驗血液學雜志，2014，22（6）：1561-1566.

[3] Yoo K H，Hennighausen L.EZH2 methyltransferase and H3K27 methylation in breast cancer[J].Int J Biol Sci，2012，8（1）：59-65.

[4]鄧玉潔，陳剛，朱偉峰，等.H3K27的三甲基化蛋白在初治彌漫大B細胞淋巴瘤的表達及對預后的影響[J].中國實驗血液學雜志，2016，24（5）：1379-1385.

[5] Specht E，Kaemmerer D，S?nger J，et al.Comparison of immunoreactive score，HER2/neu score and H score for the immunohistochemical evaluation of somatostatin receptors in bronchopulmonary neuroendocrine neoplasms [J].Histopathology，2015，67（3）：368-377.

[6]石遠凱，孫燕，于金明，等.中國晚期原發性肺癌診治專家共識（2016年版）[J].中國肺癌雜志，2016，19（1）：1-14.

[7]王文，李道堂，王壽強.表觀遺傳學在肺癌診治中的研究進展[J].中華腫瘤防治雜志，2012，19（2）：150-153.

[8]方淑斌，方楚玲，張貝，等.組蛋白修飾與miRNA在小細胞肺癌中的研究進展[J].醫學綜述，2014，20（4）：577-580.

[9]劉邦卿，杜振宗.肺癌表觀遺傳治療的研究進展[J].廣東醫學，2015，36（13）：2106-2108.

[10]楊贇，黃艷.組蛋白H3K27去甲基化酶UTX在腫瘤研究中的作用[J].中國老年學雜志，2016，36（9）：2278-2280.

[11]王先火，趙秀娟，邱立華，等.腫瘤發生的表觀遺傳學：進展與臨床意義[J].北京大學學報（醫學版），2012，44（5）：701-707.

（收稿日期：2017-03-08）endprint