微生物絮凝劑產生菌的篩選及培養條件研究

劉云++王琳+賈保軍

微生物絮凝劑是利用微生物技術，通過生物發酵、抽提、精制而得到的一種具有生物分解性和較高安全性的新型、高效、無毒的廉價水處理劑，目前國內外研究者已經篩選到了許多能夠產生絮凝劑的微生物。產生絮凝劑菌分布廣泛，在土壤與污水中分布較多，且種類繁多。目前對微生物絮凝劑的研究還多局限于實驗室水平的菌種篩選及特性研究。 獲得高活性微生物絮凝劑產生菌， 研究其培養條件， 降低生產成本是后續研究和開發應用的基礎。

本文通過對污水處理廠活性污泥的分離篩選，得到4株具有較高絮凝活性的菌株，并分析其最優的培養條件，為高活性微生物絮凝劑的產生及其實際應用提供了基礎數據。

材料與方法

菌種的來源。本研究以某污水處理廠的活性污泥為對象，篩選得到4株具有絮凝活性的微生物絮凝劑產生菌，并對其最佳培養條件進行優化實驗。

菌種的分離與篩選。（1）篩選培養基（GC液體培養基）：葡萄糖20g，酵母浸膏0.5g，脲0.5g，K2HP04 5g，KH2P04 2g，NaCl 0.1g， （NH4）2S04 0.2g，水l000mL，pH =8.0，121℃滅菌20min；（2）分離與篩選 采用倒平板法和分離劃線法進行菌種的分離。對培養2-3d的培養皿進行觀察，根據形態和顏色的差異，分離得到較純的微生物菌株。將分離得到的菌株接種到篩選培養基中，于32±0.5℃，150r/min培養72h，對發酵液進行初步絮凝活性的檢測，得到絮凝活性較高的菌株。

絮凝活性的測定。在50mL具塞比色試管中加入2mLl%CaCl2溶液，0.2g高嶺土，定容，調節pH值為9，再加入3mL培養液搖勻，靜置10min，吸取上清夜于比色皿中，于紫外可見分光光度計在660nm處測定上清夜的吸光度（OD660），以不加發酵液的培養基為對照。通過計算確定其絮凝活性。

絮凝率（%）=（A-B）/A×100%

式中：A——對照在660nm處的吸光度

B—樣品在660nm處的吸光度

培養條件的優化。對篩選出來的四株菌株， 分別改變培養條件， 如培養基的成分及初始pH值、培養溫度、搖床轉速等因素，測定培養液的絮凝活性， 以確定微生物產絮凝劑的最優培養條件。

結果與分析

分離篩選結果。通過菌種的分離，并將純化后的菌株經初篩和復篩后共獲得4株具有較強絮凝活性的菌株，初步確定并將其編號為1#細菌，2#放線菌，3#霉菌，4#酵母菌。

影響微生物生長及其絮凝活性的條件分析。（1）碳源濃度對菌株的影響。碳源能夠供給微生物生長、繁殖和活動的能量，并且是微生物細胞合成的主要物質構成。本實驗選擇葡萄糖作為微生物培養的碳源，將篩選出的四株菌株轉到優化培養基中，通過改變葡萄糖的濃度，控制在150r/min ，32℃條件下培養72h，測定4株菌株的絮凝率，分析培養基中最佳的碳源濃度。其濃度不同對產絮凝劑的影響如表1所示。

由圖1可以看出，在以葡萄糖為主要碳源，經相同培養條件，測定1#細菌、2#放線菌、3#霉菌及4#酵母菌的絮凝率最高分別為81.27%、85.62%、82.17%和87.55% ，而且葡萄糖濃度對絮凝活性的有較大的影響，碳源濃度過低，則不能為微生物提供足夠的生長能量，但是濃度過高不僅對絮凝率沒有很大的提高，反而會由于碳氮比過高而造成營養比例失衡，影響微生物的生長。通過實驗結果分析，本實驗的1#細菌、2#放線菌、3#霉菌及4#酵母菌的碳源濃度分別為7g/L、10g/L、9g/L、15g/L。

（2）（NH4）2SO4的濃度對絮凝率的影響。在微生物培養的過程中，氮源是構成微生物體的蛋白質、核酸等化合物的重要原材料，對微生物的生長發育有著重要作用。有研究表明，氮源中的酵母膏和（NH4）2SO4過量或者不足對微生物生長及其絮凝劑的產生影響最大。因此控制最佳碳源濃度條件下，培養基中（NH4）2SO4的濃度對微生物的影響，結果如圖2所示。

由圖2可以看出，四株菌在不同的（NH4）2SO4濃度下，絮凝活性有較大幅度的變化，并且由圖可以看出1#細菌、2#放線菌、3#霉菌及4#酵母菌在（NH4）2SO4濃度分別為0.26 g/L、0.3 g/L、0.36 g/L、0.24 g/L條件下，絮凝率分別可達86.47%、82.76%、89.29%、73.57%，其中3#霉菌的絮凝率最高，可達89%以上。

（3）培養液的初始pH值的影響。pH值通過改變生物體的表面電荷，影響生物酶的活性和有機化合物的離子化程度，與微生物的代謝活動有密切的影響。在最優葡萄糖濃度、（NH4）2SO4濃度，控制不同pH值，于32℃、150r/min條件下培養72h，測定培養液的絮凝活性，分析pH值對微生物生長的影響。實驗結果見圖3。

由圖3可以看出，當pH位置在6～8范圍內時，1#細菌、2#放線菌和3#霉菌微生物的培養發酵液有較高絮凝活性，當pH大于8時，絮凝活性迅速下降。而4#酵母菌最佳pH值在7左右，絮凝率隨pH的變化不明顯，因此具有有較好的酸堿穩定度。

（4）搖床轉速的影響。在最優葡萄糖濃度、（NH4）2SO4濃度以及最佳pH值條件下，控制不同轉速于32℃進行振蕩培養72h，并測定相應培養液的絮凝活性，實驗結果如圖4所示。

搖床轉速的大小直接影響微生物生長所需的通氧量。轉速過低，不能為菌體的生長提供足夠的氧氣而影響其生長。而轉速過高，導致通氣量大，微生物的生長繁殖過快，及早進入衰亡階段，絮凝劑的產量降低。因此在實際應用中要充分考慮合適的通氧量，保證菌體的生長和絮凝劑的合成。 由圖4實驗結果可知，搖床轉速控制在160r/min時，4株菌株都具有交到的絮凝率，最高可達90%以上。

（5）培養溫度對絮凝劑產生菌的影響。微生物的培養溫度是微生物生長和存活的重要因素之一。微生物絮凝劑的主要成分為蛋白質、核酸、糖類等，其中蛋白質、核酸等對溫度具有較高的敏感性，過高或過低的溫度會對機體產生嚴重影響，因此，需要分析不同的微生物對溫度的適應范圍，通過控制最佳的葡萄糖濃度、（NH4）2SO4濃度、pH值以及最佳的轉速，設定不同的培養溫度，振蕩培養72h，測定培養液對高嶺土懸液的絮凝活性，結果見圖5。

由圖5可知，培養溫度34℃時4#酵母菌的絮凝率為92.21%，1#細菌和2#放線菌在30℃時，其絮凝率最高，達到87.58%和82.58%， 3#霉菌在32℃的絮凝率達83.45%，遠高于其它溫度時的絮凝率，因此本實驗所用的4株菌株的最佳培養溫度應控制在30℃～34℃范圍內。

本文通過菌種的篩分得到4株具有較高絮凝活性的菌株，確定為1#細菌、2#放線菌、3#霉菌、4#酵母菌。實驗結果表明，1#細菌、2#放線菌、3#霉菌、4#酵母菌的最佳培養條件分別為：葡萄糖濃度為7g/L， 10 g/L， 15 g/L， 9 g/L，（NH4）2SO4的濃度分別為0.26 g/L、0.3 g/L、0.36 g/L、0.24 g/L，培養液的初始pH值為8、7、7、7.5，最佳搖床轉速控制在160r/min，最佳培養溫度為30℃、30℃、34℃、32℃。并且在其各自最佳培養條件下，其絮凝活性最高可達85%～90%以上。

基金項目：河南省教育廳自然科學基金項目（2011A610008），河南理工大學博士基金項目（648206）。

作者簡介：

賈保軍（1974-），男，河南新鄉人，博士，副教授，研究方向：水污染控制。endprint