濃醬兼香型酒醅中產醬香芽孢桿菌的篩選及發酵風味成分分析

王 霜，繆禮鴻*，張明春，劉蒲臨，劉俊超

（1.武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023；2.湖北白云邊酒業股份有限公司，湖北 松滋 434200）

濃醬兼香型酒醅中產醬香芽孢桿菌的篩選及發酵風味成分分析

王 霜1，繆禮鴻1*，張明春2，劉蒲臨1，劉俊超1

（1.武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023；2.湖北白云邊酒業股份有限公司，湖北 松滋 434200）

該研究從兼香型白酒不同輪次酒醅中篩選到兩株堿性蛋白酶活較高并對乙醇具有較好耐受性的菌株，分別為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）LS9和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）S10，其液態發酵產堿性蛋白酶活性分別可達（163.82±15.85）U/mL和（241.69±20.07）U/mL，二者均能在含體積分數6%乙醇的培養基中生長良好。菌株LS9和S10均能產生典型的醬香風味。氣質分析結果表明，菌株LS9和S10發酵后代謝產生了5-甲基糠醛、β-苯乙醇、苯乙酸、α-亞麻酸等新的風味成分。菌株LS9和S10在小麥固體培養基中均具有一定的發酵產乙偶姻能力，在28℃恒溫條件下乙偶姻產量分別為（65.15±6.15）mg/L和（41.33±4.82）mg/L，35℃→45℃→55℃升溫培養條件下的乙偶姻產量分別為（41.21±3.27）mg/L和（26.91±2.97）mg/L。

兼香型酒醅；芽孢桿菌；堿性蛋白酶活；風味成分

濃醬兼香型白酒是在我國傳統醬香型和濃香型白酒的基礎上發展起來的，其中白云邊酒是濃醬兼香型白酒的典型代表[1]，其采用大曲醬香型白酒和濃香型白酒相結合的生產工藝，前6輪為醬香型生產工藝，后3輪采用濃香型生產工藝[2-3]。因此醬香型白酒的生產工藝對兼香酒的出酒率及酒品質量具有較大影響。醬香大曲中的微生物代謝產物對醬香白酒的風格具有重要貢獻[4-5]。醬香大曲制作過程中微生物代謝產生的蛋白酶可將原料中的粗蛋白降解成各種氨基酸，淀粉酶可將淀粉降解成糖，氨基酸和糖在特定的環境中可發生美拉德反應生成具有醬香風味的物質，此外氨基酸在受熱分解時也可產生醬香風味物質[6]。白酒發酵過程中的高產蛋白酶活菌株一方面可提高氨基酸含量，從而增加白酒中的風味物質，另一方面還可提高白酒的產量和質量[7]。高產蛋白酶細菌的分離篩選，有助于醬香大曲中高產蛋白酶微生物的研究，對生產出優良的醬香大曲和醬香白酒具有重要意義[8]。

本研究對濃醬兼香型白酒酒醅中分離出的細菌進行蛋白酶活、產醬香能力及耐酒精能力測定，從中篩選出具有產醬香功能的優良菌株，為開發醬香功能強化曲提供優良菌株來源并為揭示濃醬兼香型白酒醬香風味來源提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來源及原料

菌株由本實驗室從白云邊不同輪次入池酒醅和出池酒醅中分離的25株芽孢桿菌[9]，其中地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis）11株，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）11株、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）3株。

小麥：由湖北白云邊酒業股份有限公司提供。

1.1.2 試劑

福林試劑：上海荔達生物科技有限公司；無水碳酸鈉（分析純）：天津市科密歐化學試劑開發中心；三氯乙酸（分析純）：上海山浦化工有限公司；磷酸二氫鈉（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）：山東西亞化學工業有限公司；干酪素、酪氨酸（分析純）：北京奧博星生物技術有限責任公司。無水乙醇（分析純）、二氯甲烷（CH2Cl2）（色譜純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；乙偶姻（分析純）：上海市麥克林生化科技有限公司。

1.1.3 培養基

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、水1 000 mL，pH 7.0～7.2，固體培養基中加入2%的瓊脂，121℃滅菌20 min。

葡萄糖蛋白胨液體培養基：蛋白胨5 g、葡萄糖5 g、K2HPO42 g、水1 000 mL，pH 7.0～7.2，115 ℃滅菌20 min。

產蛋白酶發酵培養基[10]：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、蔗糖10g、磷酸氫二鈉4g、硫酸鎂0.2g、水1000mL，pH7.2，121℃滅菌30 min。

小麥固體培養基：將小麥粉碎后的顆粒和面粉的混合物按料水比1∶0.4加水后浸潤過夜，在沸水鍋上蒸熟1 h，按照100 g/250 mL分裝到三角瓶中，121℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

FW177高速粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；ZHJH-CH15B超凈工作臺、ZXSD-A1270恒溫培養箱、ZHWF-2102恒溫搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；UV-5900PC分光光度計：上海元析儀器有限公司；RV8V旋轉蒸發儀：德國艾卡公司；GC7890A-MS5975C氣質聯用儀、7820A氣相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 高產蛋白酶活菌株的篩選

將分離自白云邊酒醅的25株芽孢桿菌經牛肉膏平板活化后接種至牛肉膏蛋白胨液體培養基中，30℃、170 r/min搖床培養12 h，將培養的種子液按照3%的接種量接種至產蛋白酶發酵培養基中，37℃、170 r/min培養48 h，按照國標福林-酚試劑法測定各菌株發酵液堿性蛋白酶活[11]，單位為U/mL，每個菌株3瓶重復。

1.3.2 產醬香芽孢桿菌的篩選及產乙偶姻芽孢桿菌的培養

從不同種類芽孢桿菌中挑選蛋白酶活大小不同的菌株，接種至葡萄糖蛋白胨液體培養基37℃、170 r/min培養24 h，按照10%的接種比例接種至小麥固體培養基中，并設置空白組（未接種小麥固體培養基），按照35℃→45℃→55℃升溫培養，每個溫度段各培養2 d，篩選出具有產醬香功能的芽孢桿菌，每個菌株3瓶重復，曲香感官評定標準見表1[12]。綜合評分是5個人重復3次試驗的綜合評價結果，滿分10分。

表1 曲香感官評定標準Table 1 Sensory evaluation standards of Daqu flavor

將篩選到的產醬香芽孢桿菌分別置于28℃恒溫培養6 d和35℃→45℃→55℃升溫培養，每個溫度段各培養2 d。測定不同培養溫度對乙偶姻含量的影響，每個菌株3瓶重復。

1.3.3 耐酒精能力的測定

向LB培養基中分別加入不同體積比的無水乙醇配制成含不同體積分數乙醇的培養基，將待測菌株經牛肉膏蛋白胨培養液活化后，按0.1%的接種量接入含乙醇的LB培養基中，培養條件為37℃、170 r/min搖床培養，取發酵液稀釋后測定OD600nm值，每12 h檢測一次。

1.3.4 風味成分分析

（1）風味成分的提取

取方法1.3.2中產醬香發酵樣品50 g加入體積分數50%乙醇100mL，30℃超聲波處理40min，結束后離心收集上清液，按照上清液體積1∶1加入CH2Cl2，充分混勻后收集萃取相，將收集到萃取液通過減壓蒸餾，濃縮至無水，加CH2Cl2定容至5 mL作為最終萃取樣品。

（2）氣相色譜質譜分析

通過DB-Wax毛細管柱進行氣相質譜分析，程序升溫條件為：初溫50℃，恒溫2 min，然后以6℃/min的速率升至230℃，保持30min。進樣量：1μL，不分流。載氣：氦氣（He）；流速：2 mL/min；分離后的樣品用Agilent 5975MSD鑒定。質譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量：70 eV；離子源溫度：230℃；掃描范圍：30～550 amu[13]。

（3）乙偶姻含量測定

固液萃取：取1.3.2中發酵樣品50 g加入體積分數50%乙醇100 mL，30 ℃、170 r/min振蕩1 h，結束后加入5 mL CH2Cl2充分混勻靜置，收集下層萃取相，8000r/min離心1min取上清液濾膜過濾后即為萃取樣品。氣相色譜分析方法：樣品通過CP-Wax57CB毛細管柱進行分離，程序升溫條件：初溫80℃，恒溫2 min，然后以5℃/min的速率升至200℃，保持30 min。進樣量：1 μL，不分流。載氣：氮氣（N2）；流速：2 mL/min。進樣口與檢測器溫度：200℃。

乙偶姻標準溶液配制：準確稱取0.1g乙偶姻，用無水乙醇定容至25 mL，使用前，用無水乙醇分別稀釋至25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L，繪制乙偶姻標準曲線，根據測定結果帶入標準曲線方程計算乙偶姻含量。

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌蛋白酶活測定結果

對25株芽孢桿菌的堿性蛋白酶活檢測，結果見表2。

表2 堿性蛋白酶活檢測結果Table 2 Determination results of alkaline protease activity

由表2可知，菌株JCB3-1-1（LS9）和JRB7-1-1N（S10）的蛋白酶活分別為（163.82±15.85）U/mL和（241.69±20.07）U/mL，明顯較其他菌株高，其余6株蛋白酶活較高菌株分別為CRB7-1-1N、CRB6-1-2M（LS6）、CCB7-1-1M（S13）、JRB3-1-2、JRB4-1-2和CCB6-1-3M（AS1）。結合以上8株堿性蛋白酶活較高菌來源進行分析后發現，其中有5株菌均分離自不同輪次入池酒醅中。5株產堿性蛋白酶活較低菌株分別為JRB3-1-3（LS23）、JCB4-1-1M（AS3）、CCB7-1-3N、CCB7-1-2N（LS16）和JCB7-1-2N，其中4株均分離自出池酒醅中。以上結果表明，堿性蛋白酶活較高菌株多分離自高溫堆積后入池酒醅中，而堿性蛋白酶活較低菌株多分離自發酵結束后出池酒醅中。

2.2 產醬香功能菌株的篩選結果

2.2.1 產醬香能力鑒定

從不同種類芽孢桿菌中選擇5株堿性蛋白酶活較高的菌株，編號分別為LS9（JCB3-1-1）、S10（JRB7-1-1N）、S13（CCB7-1-1M）、AS1（CCB6-1-3M）和LS6（CRB6-1-2M）和3株堿性蛋白酶活較低菌株，編號分別為LS23（JRB3-1-3）、LS16（CCB7-1-2N）和AS3（JCB4-1-1M），進行產醬香發酵實驗，結果見表3。

表3 不同芽孢桿菌產醬香能力分析Table 3 Sauce flavor production of differentBacillusstrains

由表3可知，菌株LS9和S10兩株堿性蛋白酶活較高菌株的產醬香能力明顯較其他菌株強，菌株LS9和S10即為篩選得到的產醬香功能菌株。此外菌株LS23、LS16和AS3三株蛋白酶活較低菌株的產醬香能力也明顯較弱，表明芽孢桿菌的產醬香能力與其產蛋白酶活的高低有一定的相關性。

2.2.2 芽孢桿菌耐酒精生長能力測定結果

菌株LS9和S10在含不同乙醇體積分數的LB培養液中的生長狀況如圖1所示。由圖1a和1b可知，菌株LS9和S10在乙醇體積分數為2%的培養基中，生長不受影響，但隨著乙醇體積分數的提高，兩種菌的生長開始受一定程度的抑制。菌株LS9和S10在乙醇體積分數為6%時仍能生長良好，培養到48h，OD600nm值可達3.0左右；但當乙醇體積分數達到8%時，兩株芽孢桿菌的生長均受到明顯抑制；當乙醇體積分數為10%時，菌株LS9和S10基本都不生長，結果表明，菌株LS9和S10均可耐受體積分數6%左右的乙醇。

圖1 不同乙醇體積分數條件下的菌株LS9（a）及S10（b）生長曲線Fig.1 Growth curves of strain LS9(a)and S10(b)under different ethanol concentration

2.3 產醬香風味成分的分析

表4 兩株芽孢桿菌發酵產香氣成分檢測結果Table 4 Aroma components determination results of twoBacillus strains fermentation

兩株芽孢桿菌在小麥固體培養基中的產醬香發酵產物的氣質分析結果見表4。由表4可知，與不接種的小麥原料空白組相比，接種菌株LS9和S10的發酵基質中有12種新的代謝產物：乙酸、5-甲基糠醛、異戊酸、苯乙醇、苯酚、2-吡咯烷酮、苯乙酸、肉豆蔻酸、十七烷酸、棕櫚油酸、硬脂酸、α-亞麻酸。其中菌株LS9代謝產生的5-甲基糠醛屬呋喃類物質，呋喃類物質也是報道的醬香型白酒的重要呈香物質和特征化合物[14]；2-吡咯烷酮、肉豆蔻酸和十七烷酸由菌株S10代謝產生；菌株LS9和S10的產醬香發酵實驗中都有檢出乙酸、異戊酸、β-苯乙醇、苯酚、苯乙酸、棕櫚油酸和α-亞麻酸等物質；其中含量較高的苯乙酸可作為生產香精的原料，在菌株LS9和S10中相對含量分別為8.88%和6.65%；α-亞麻酸具有降壓、抗癌、改善心腦血管疾病和預防過敏等保健功能[15]，這一物質可能成為白酒中的健康功能因子，在接種菌株LS9和S10的發酵基質中相對含量分別為3.00%和3.65%。

2.4 菌株LS9和S10發酵產乙偶姻的測定結果

將不同質量濃度的乙偶姻標準品溶液進行氣相色譜測定，以峰面積為縱坐標，乙偶姻質量濃度為橫坐標建立標準曲線，線性回歸方程為y=6 930.5x-99 013（R2＞0.99），結果表明，乙偶姻在25～400 mg/L范圍內線性關系良好。

兩株芽孢桿菌發酵產乙偶姻的檢測結果見表5。結果表明，菌株LS9和S10在小麥培養基中均能產生較高含量的乙偶姻，LS9在小麥培養基中經28℃恒溫培養和35℃→45℃→55℃升溫培養后乙偶姻含量分別為（65.15±6.15）mg/g和（41.21±3.27）mg/g，菌株S10分別為（41.33±4.82）mg/g和（26.91±2.97）mg/g，兩種條件下菌株LS9的乙偶姻產量都較菌株S10高。此外菌株LS9和S10在35℃→45℃→55℃升溫培養條件下代謝產生的乙偶姻含量都較28℃恒溫培養條件下低，分析可能有以下兩個方面的原因：一方面是28℃恒溫條件下適合芽孢桿菌大量生長，乙偶姻在發酵過程中不斷積累，而55℃高溫對芽孢桿菌生長有一定影響，因此發酵后期乙偶姻產量有所下降；另一方面在55℃高溫環境中，微生物分解蛋白質代謝產生的氨和乙偶姻開始發生反應生成了四甲基吡嗪[16]，因此乙偶姻含量有所下降。

表5 兩株芽孢桿菌發酵產乙偶姻含量測定結果Table 5 Determination results of acetoin contents by twoBacillus strains fermentation

3 結論

對分離自濃醬兼香型白酒酒醅中的25株芽孢桿菌進行了堿性蛋白酶活測定，從中篩選出兩株堿性蛋白酶活較高菌株地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）LS9和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）S10。結果表明，菌株LS9在28℃和35℃→45℃→55℃培養條件下乙偶姻產量分別為（65.15±6.15）mg/L和（41.21±3.27）mg/L，菌株S10產量分別為（41.33±4.82）mg/L和（26.91±2.97）mg/L，兩株菌均具有較好的產醬香功能和較高的產乙偶姻能力，并可耐受體積分數為6%左右的乙醇，菌株LS9和S10在28℃恒溫條件下乙偶姻產量分別為（65.15±6.15）mg/L和（41.33±4.82）mg/L，較35℃→45℃→55℃升溫培養條件下的乙偶姻產量高，更有利于代謝產生乙偶姻。

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Analysis of the flavor compounds fermented by sauce-flavor-producingBacillusstrain isolated from fermented grains of mixed strong-sauce-flavorBaijiu

WANG Shuang1,MIAO Lihong1*,ZHANG Mingchun2,LIU Pulin1,LIU Junchao1
(1.School of Biology and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China;2.Hubei Baiyunbian Distillery Co.,Ltd.,Songzi 434200,China)

Bacillus licheniformisLS9 andBacillus subtilisS10,with higher alkaline protease activity and ethanol tolerance were isolated from different batches of fermented grains of mixed-flavorBaijiu(Chinese liquor),the alkaline protease activityof these two strains achieved(163.82±15.85)U/ml and (241.69±20.07)U/ml during liquid-state fermentation,respectively.Both strains grew well in the medium containing ethanol 6%,and strains LS9 and S10 produced typical Moutai flavor.Results of GC-MS analysis showed that strains produced volatile compounds,including 5-methyl furfural,β-phenylethanol,phenylacetic acid,α-linolenic acid,etc.Strains LS9 and S10 had acetion-producing ability in solid wheat medium.The yield of acetoin under the condition of constant temperature of 28 ℃ were(65.15±6.15)mg/L and(41.33±4.82)mg/L,the yield of acetoin under the condition of warming culture of 35℃→45℃→55℃were(41.21±3.27)mg/L and(26.91±2.97)mg/L.

mixed flavor fermented grains;Bacillus;alkaline protease activity;flavor component

Q939.99

0254-5071（2017）10-0061-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.014

2017-04-13

湖北省重大科技創新計劃項目資助（2013ABA008）

王 霜（1987-），男，碩士研究生，研究方向為釀酒微生物學。

*通訊作者：繆禮鴻（1965-），男，教授，博士，研究方向為釀酒微生物學。