肉蓯蓉低分子糖對巨噬細胞激活作用的研究

張雨荷　王麗超　屠鵬飛　曾克武　姜勇

[摘要]探究肉蓯蓉低分子糖對RAW2647小鼠巨噬細胞的激活作用及潛在機制。該實驗將RAW2647細胞分為正常對照組、細菌脂多糖（LPS）陽性對照組、肉蓯蓉低分子糖處理組，其中肉蓯蓉低分子糖的給藥濃度為391～625 g·L-1。采用中性紅法檢測巨噬細胞吞噬活性，一氧化氮（NO）試劑盒檢測NO的釋放量，Western blot法檢測巨噬細胞激活相關蛋白（TNFα，IL6，IKKβ，pIKKβ，IκBα，pIκBα，NFκB，pNFκB）的表達。結果顯示，肉蓯蓉低分子糖對巨噬細胞具有激活作用，具體表現在：其可顯著提高RAW2647細胞NO的釋放量，并促進細胞因子TNFα和IL6的表達。同時，其還可顯著提高NFκB的磷酸化及其上游關鍵信號蛋白IKKβ和IκBα的磷酸化水平。另外，低分子糖中的甘露醇可以使巨噬細胞的吞噬活性顯著提升。以上結果表明，肉蓯蓉低分子糖對巨噬細胞具有激活作用，其潛在機制是通過NFκB信號通路來實現的，甘露醇可能是其中的一種關鍵活性單體成分。

[關鍵詞]肉蓯蓉低分子糖； 免疫激活； 巨噬細胞； 炎癥因子； NFκB

[Abstract]To investigate the immune activation effect and mechanism of low molecular weight saccharides from Cistanche deserticola（LMSC） on mouse peritoneal macrophages， RAW2647 cells The RAW2647 cells were divided into the normal control group， LPS positive control group， and LMSC treatment groups The RAW2647 cells were treated with various concentrations of LMSC from 391 to 625 g·L-1 The neutral red assay was employed to detect the phagocytic activity of macrophages NO release was detected by using NO kit， and macrophage activation associated protein expression levels （TNFα， IL6， IKKβ， pIKKβ， IκBα， pIκBα， NFκB， and pNFκB） were detected by Western blot Results showed that LMSC had an activation effect on macrophages； it can significantly increase the release of NO in RAW2647 cells and promote the expression of cytokines TNFα and IL6 Moreover， LMSC significantly increased the phosphorylation of IKKβ， IκBα， and NFκB p65 Furthermore， mannitol′s one of the main constituents in LMSC significantly enhanced the phagocytic activity of macrophages These results showed that LMSC could activate macrophages by upregulating the NFκB signaling pathway， and mannitol may be one of the main active components in LMSC.

[Key words]Low molecular weight saccharides； Cistanche deserticola； immune activation； macrophage； inflammatory factor； NFκB

肉蓯蓉Cistanche deserticola Y C Ma為列當科肉蓯蓉屬植物，其肉質莖可入藥，具有補腎陽、益精血、潤燥通腸等功效，被譽為“沙漠人參”。肉蓯蓉的化學成分包括苯乙醇苷類、環烯醚萜苷、糖類、木脂素類等多種類型。現代藥理學研究發現，肉蓯蓉具有神經保護、抗腫瘤、免疫調節、抗炎、抗氧化等諸多生物學活性[1]。有研究表明，肉蓯蓉的水煎物以及多糖都可明顯提高巨噬細胞吞噬能力以及分泌功能[23]。但是，對于其低分子糖類的活性研究尚未見報道。因此，本研究利用RAW2647小鼠腹腔巨噬細胞體外培養體系，探討了肉蓯蓉低分子糖類的免疫調節活性及相關機制。該研究可為今后全面理解肉蓯蓉的免疫調節作用提供更多的實驗證據，從而進一步指導其臨床應用。

1材料

RAW2647細胞購自中國醫學科學院細胞中心；胎牛血清（FBS）購自德國PAN Biotech公司；抗生素、DMEM培養基購自中科邁晨科技有限公司。大腸桿菌脂多糖（lipopolysaccharide from Escherichia coli O55：B5，LPS）購自美國Sigma公司。一氧化氮（NO）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。ECL化學發光試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；肉蓯蓉總苷、肉蓯蓉低分子糖、肉蓯蓉多糖由本課題組自制，其中肉蓯蓉總苷的質量分數為7876%，肉蓯蓉低分子糖的質量分數為5800%，肉蓯蓉多糖的質量分數為6524%。Tanon5200Multi凝膠成像分體系統購自上海天能科技有限公司；SunriseBasic酶標儀購自TECAN公司。endprint

2方法

21中性紅法測定巨噬細胞吞噬活性取對數生長期的小鼠腹腔巨噬細胞，胰酶消化后，進行細胞計數，將細胞數調整為5×104個/mL，接種于96孔細胞培養板，100 μL/孔，于37 ℃，5%CO2條件下進行培養，待細胞貼壁后，棄去培養上清液，分別加入DMEM培養基（10%FBS+1%P/S），LPS（1 mg·L-1）以及肉蓯蓉總苷、肉蓯蓉總多糖、肉蓯蓉低分子糖（分別為391～625 g·L-1，給藥前用濾膜過濾）進行培養。培養48 h后，每孔加入0075%中性紅生理鹽水溶液100 μL，繼續培養4 h，吸棄上清液，用PBS洗3遍，每孔加入細胞裂解液（冰醋酸乙醇1∶1）100 μL，4 ℃下放置2 h，待細胞裂解后測定吸光度（A540 nm）。

22細胞上清液中NO釋放量檢測將RAW2647細胞接種于48孔板（1×105個/mL，500 μL/孔），過夜孵育后吸棄細胞培養基，分別加入DMEM培養基（10%FBS+1%P/S），LPS（1 mg·L-1）以及肉蓯蓉總苷、總多糖、低分子糖（分別為391～625 g·L-1）各500 μL。誘導培養24 h后，收集上清液。用NO試劑盒測定各組細胞上清液中NO濃度，按照說明書操作，最后用酶標儀檢測吸光度（A570 nm）。

23Western blot將RAW2647細胞接種于6孔板，過夜孵育后吸棄細胞培養基，分別加入DMEM培養基（10%FBS+1%P/S），LPS（1 mg·L-1）以及肉蓯蓉總多糖、低分子糖（391～625 g·L-1）各2 mL，誘導培養24 h后，棄去上清液。細胞用PBS洗2遍，棄去。胰酶消化后，將細胞吹打下來。離心，去上清液，加入100 μL NP40裂解液，冰上裂解40 min。離心后取上層清液，BCA法測定蛋白濃度，并調勻各組蛋白濃度。

取等量蛋白樣品于12%SDSPAGE，恒壓條件下進行分離。然后用BioRad轉移電泳槽350 mA恒流轉膜1 h，將蛋白轉移至PVDF膜上（PVDF膜的預處理：甲醇浸泡后用轉膜緩沖液平衡）。室溫下用5%脫脂牛奶（用含有01%吐溫20的TBST配置）封閉1 h后，用TBST洗膜3次，將膜置于蛋白一抗稀釋液中4 ℃過夜孵育。隔天用TBST洗膜3次，加入相應二抗稀釋液，孵育1 h，TBST洗膜3次，用ECL化學發光顯影液對條帶顯影。

24數據分析數據均采用±s表示，差異顯著性檢驗采用GraphPad Prism 6統計軟件進行單因素方差分析。以P< 001作為具有非常顯著性差異，P<005為具有顯著性差異。

3結果

31肉蓯蓉低分子糖、總苷以及總多糖對RAW2647細胞吞噬活性的影響有關肉蓯蓉化學成分的研究表明，肉蓯蓉中主要含有苯乙醇苷、環烯醚萜苷類和糖類成分，本實驗選擇肉蓯蓉總苷（含苯乙醇苷和環烯醚萜苷）、低分子糖和總多糖3種活性部位考察其對RAW2647細胞激活的影響。肉蓯蓉多糖和肉蓯蓉低分子糖均能顯著提高RAW2647細胞的吞噬活性，而總苷部位給藥組的細胞吞噬活性變化不明顯。此外，陽性對照藥LPS也明顯提高了RAW2647細胞的吞噬活性，見圖1。以上結果提示，肉蓯蓉低分子糖和多糖可能具有激活RAW2647細胞的作用。

與對照組相比1） P<001，2） P<005（圖2～5同）。

32肉蓯蓉總苷、低分子糖和總多糖對細胞上清液中一氧化氮（NO）含量的影響為進一步考察肉蓯蓉3種活性部位對RAW2647細胞的激活作用，分別測定了不同藥物刺激后的細胞上清液中NO的含量。結果顯示，LPS組NO釋放量顯著高于空白對照組（P<001）；肉蓯蓉低分子糖和多糖5個劑量的給藥組NO釋放量皆顯著高于對照組（P<001），且呈劑量依賴性；肉蓯蓉總苷沒有顯著影響。以上結果表明，肉蓯蓉多糖和低分子糖均有促進RAW2647細胞釋放NO的作用，其中肉蓯蓉低分子糖效果尤其顯著，見圖2。

33肉蓯蓉低分子糖對RAW2647細胞TNFα和IL6蛋白表達的影響TNFα是RAW2647細胞激活反應過程中出現的一種重要的炎性介質，可以促使其他細胞因子（如IL6）的合成和釋放。結果顯示，肉蓯蓉低分子糖刺激后，TNFα和IL6的表達量顯著提高，提示肉蓯蓉低分子糖可能通過促進RAW2647細胞表達TNFα和IL6蛋白，進而激活細胞的免疫吞噬功能，見圖3。

34肉蓯蓉低分子糖對IKKβ/IκBα/NFκB信號通路的調控作用為了探究肉蓯蓉低分子糖激活RAW2647細胞的潛在作用機制，作者考察了其對IKKβ/IκBα/NFκB經典信號通路的調控作用。肉蓯蓉低分子糖能夠顯著提高NFκB磷酸化以及其上游的關鍵信號蛋白IKKβ和IκBα的磷酸化，并且降低IκBα總蛋白的表達，表明其對IKKβ/IκBα/NFκB信號通路具有激活作用。陽性對照藥LPS也具有類似的調控效果。綜上所述，肉蓯蓉低分子糖可能通過激活IKKβ/IκBα/NFκB信號通路，進而引起TNFα和IL6等細胞因子的合成與釋放，最終引起RAW2647細胞的免疫激活，見圖4。

35肉蓯蓉低分子糖中具有巨噬細胞激活作用的活性成分篩選本實驗室前期已對肉蓯蓉所含的低分子糖類進行了分析，發現主要含有甘露醇（1653%）、蔗糖（834%）、果糖（2538%）、葡萄糖（775%）等成分。于是作者利用中性紅法對上述成分對巨噬細胞的激活作用進行了篩選。甘露醇可顯著提高巨噬細胞的吞噬活性，且具有劑量依賴性，而其他成分作用不顯著。這提示甘露醇可能是肉蓯蓉低分子糖中激活巨噬細胞的關鍵活性成分之一，見圖5。

4討論

列當科寄生植物肉蓯蓉被報道具有免疫調節作用，因此其應該含有免疫調節作用的物質。本實驗中，作者對肉蓯蓉的不同純化部位進行小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性的篩選后，發現肉蓯蓉低分子糖和肉蓯蓉多糖具有巨噬細胞激活作用，而肉蓯蓉總苷不明顯。同時作者發現，低分子糖類在較低濃度下即可對巨噬細胞產生激活作用，因此作者選擇肉蓯蓉低分子糖類作為后續研究重點。endprint

通過檢測肉蓯蓉低分子糖對細胞因子TNFα和IL6表達的影響，作者發現肉蓯蓉低分子糖使TNFα和IL6的表達量顯著提高，這進一步證明肉蓯蓉低分子糖對小鼠腹腔巨噬細胞有激活作用。于是作者又進一步探究了其潛在的作用機制。有研究表明，細菌脂多糖（LPS）可通過JAK2/STAT3，NFκB，p38/ERK，MAPK等信號通路誘導小鼠巨噬細胞和小鼠膠質細胞活化[48]。NFκB通路是公認的一條經典通路，因此本實驗中對這條通路上的信號蛋白進行了檢測。結果發現，肉蓯蓉低分子糖能夠顯著提高NFκB磷酸化以及其上游的關鍵信號蛋白IKKβ和IκBα的磷酸化，提示肉蓯蓉低分子糖可能通過IKKβ/IκBα/NFκB信號通路激活小鼠腹腔巨噬細胞釋放炎性細胞因子，進而發揮細胞免疫激活作用。

實驗室前期對肉蓯蓉低分子糖提取物的化學成分進行了系統分析。發現低分子糖中主要含有甘露醇、蔗糖、果糖、葡萄糖等單體。進一步研究結果發現，甘露醇對巨噬細胞的吞噬活性有顯著的提高作用，因此推測甘露醇可能是低分子糖中具有激活細胞免疫功能的關鍵成分。

綜上所述，本研究利用巨噬細胞體外培養體系，發現了肉蓯蓉低分子糖對巨噬細胞有顯著激活作用，并且可能通過NFκB信號通路激活小鼠腹腔巨噬細胞，進而發揮作用。低分子糖中的甘露醇可能對激活巨噬細胞的吞噬活性具有重要作用。

[參考文獻]

[1]屠鵬飛，郭玉海 荒漠肉蓯蓉及其寄主檉柳栽培技術[M]北京：科學出版社，2015：31.

[2]高曉霞，陳君，彭艷麗 肉蓯蓉多糖藥理作用研究概況[J]. 食品與藥品，2015，17（2）：136.

[3]王翔巖，齊云，蔡潤蘭，等肉蓯蓉多糖的巨噬細胞活化作用[J]. 中國藥理學通報，2009，25（6）：787.

[4]劉中原，李延平細菌脂多糖的生物活性及作用機制[J]. 醫學綜述，2010，16（2）：166.

[5]符智慧，徐凌，黃姣，等LPS通過p38/MAPK通路和NFκB的活化誘導RAW2647細胞HIF1α的表達[J]. 重慶醫科大學學報，2016，41（10）：1033.

[6]郝玉通，陳純海，楊學森，等 JAK2/STAT3信號通路參與脂多糖誘導小膠質細胞活化的研究[J]. 第三軍醫大學學報，2009，31（12）：1119.

[7]宋小敏，廖理曦，董馨，等 毛蕊花糖苷抑制脂多糖誘導的BV2小膠質細胞炎癥反應及機制研究[J]. 中國中藥雜志，2016，41（13）：2506.

[8]杜娟，高偉良，馮清州，等 p38 MAPK信號通路在LPS誘導RAW2647細胞表達sTREM1中的作用[J]. 中國呼吸與危重監護雜志，2015，14（2）：161

[責任編輯張寧寧]endprint