葡聚糖糖基化處理對綠豆蛋白抗氧化性影響研究

江連洲，張瀟元，伍 丹，張菀坤，張 璟，盧 燕，全惟誠，米 思，劉 爽，王中江

(東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030)

葡聚糖糖基化處理對綠豆蛋白抗氧化性影響研究

江連洲，張瀟元，伍 丹，張菀坤，張 璟，盧 燕，全惟誠，米 思，劉 爽，王中江

(東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030)

以綠豆分離蛋白(MBPI)和葡聚糖為原料，通過濕熱法制備MBPI-Dextran共價復合物。本研究通過測定產物的還原力、DPPH自由基清除能力、超氧陰離子自由基、羥自由基清除能力共同評價糖基化反應對MBPI抗氧化能力的影響。結果表明：MBPI-Dextran共價復合物具有一定的抗氧化能力，特別是90℃條件下反應得到的產物，抗氧化能力較80℃產物顯著提升，這與美拉德反應程度有關，較高溫度下美拉德反應進程加快，促使更多具有抗氧化能力的物質生成。因此，糖基化改性后的綠豆蛋白在抗氧化能力研究上具有一定的應用價值。

綠豆蛋白；葡聚糖；糖基化處理；抗氧化性

不同品種的綠豆中蛋白含量為20%～30%[1]，所含蛋白質中60%以上都是水溶性球蛋白[2]。美拉德反應被廣泛認為是有效和安全的提高蛋白質功能性質的方法[3-4]。目前的研究較多集中于利用生物酶解技術來制備綠豆肽，極少考慮利用糖基化對綠豆中的蛋白質進行改性[5-6]。本研究通過對糖基化改性后綠豆蛋白的抗氧化性進行研究，運用多種分析檢測手段，探討糖基化反應在綠豆分離蛋白中對其抗氧化能力所起的影響，同時對其作用機理進行探究，以期為拓展綠豆蛋白的應用范圍提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆分離蛋白，實驗室堿溶酸沉法自制(蛋白質含量90.76%)；葡聚糖，中國醫藥集團上海化學試劑有限公司；鄰苯二甲醛(OPA)，天津市科密歐化學試劑廠；氫氧化鈉、鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉：分析純試劑。

1.2 主要儀器設備

PH SJ-4A型實驗室pH計，中國上海雷磁公司；JJ-1增力電動攪拌器，江蘇省金壇市金城國勝實驗儀器廠；TD5M-WS臺式大容量離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；722型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1綠豆分離蛋白的制備 綠豆→浸泡12h(料液比為1∶ 10，4℃)→去皮→磨漿→用2mol/L NaOH調節pH為9.0→室溫下攪拌20min→10 000×g離心30min(4℃)→上清液用2mol/L HCl調節pH為4.0→10 000×g離心30min(4℃)→沉淀加水分散→用2mol/L NaOH調節pH值至中性→真空冷凍干燥(-50℃)→綠豆分離蛋白。

1.3.2綠豆分離蛋白—糖接枝物的制備 將綠豆分離蛋白和葡聚糖(1/1)溶解于磷酸鹽緩沖溶液中，攪拌2h至完全溶解，置于水浴鍋中反應，反應結束后迅速冷卻至室溫，離心后上清液置于蒸餾水中透析24h(4℃)，凍干成粉后置于冰箱中備用。

1.3.3接枝度測定 采用OPA法。配制OPA試劑，此試劑要現配現用。準確稱取40.0 mg的OPA溶解于1.0 mL甲醇中，再加入20%(w/w)的十二烷基硫酸鈉(SDS)2.5 mL，硼砂(0.1 mol/L)25.0 mL，β-巰基乙醇100 μL最后用蒸餾水定容到50 mL。在測定過程中，取1支干凈試管放入4.0 mL的OPA試劑以及200 μL的樣品，混勻，置于35℃的恒溫水浴鍋中水浴2 min，并用可見分光光度計于340nm下測出吸光值A340。同時，另取一支試管中放入4.0 mL OPA試劑和200 μL水作為空白對照。

接枝度可以用式(1)計算：

DG(%)=[(A0-A1)/A0]×100

(1)

式(1)中：A0—接枝反應前溶液的吸光值；A1—接枝反應后溶液的吸光值

1.3.4接枝產物褐變程度的測定 用0.1% SDS(w/w)將樣品液稀釋至蛋白濃度為0.2%(w/v)，以稀釋液做空白，在420 nm下測定吸光值A420。

1.3.5DPPH自由基清除能力測定 根據Benjakul S[7]的方法對接枝產物的DPPH自由基清除能力進行測定。當日配制0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液，避光保存。取2 mL的上述溶液，加入1 mL一定蛋白濃度的蛋白或者接枝物溶液，混合均勻后，25℃下避光反應30 min，然后測定溶液在517 nm處的吸光值。對照中樣品溶液由去離子水替代，空白中DPPH-乙醇溶液由無水乙醇替代。DPPH自由基清除能力根據式(2)計算：

(2)

式(2)中：Ac—對照的吸光值；AS—樣品溶液的吸光值；A0—空白的吸光值

1.3.6還原力測定 參照Oyaizu的方法[8]對接枝產物的還原力進行測定。取樣品0.5mL(5mg/mL)，加入濃度為0.2mol/L、pH值為6.6的磷酸鹽緩沖液2.5mL以及1%的鐵氰化鉀溶液2.5mL，充分攪拌。在恒溫水浴鍋內將混合物在5℃條件下保持恒溫20min后加入冰塊進行冷卻，再加入10%的三氯乙酸溶液2.5mL，將樣液置于3 000r/min離心機下離心10min。隨后用移液槍取上清液2.5mL，蒸餾水2.5mL以及0.1%的氯化鐵溶液0.5mL，充分攪拌，靜置10min后，并用可見分光光度計在700nm處測定溶液的吸光值。

1.3.7羥基自由基(OH·)清除能力的測定 通過Fenton體系模型[9]測定羥基自由基(OH·)的清除能力。吸取9.0mmol/L FeSO4和9.0mmol/L水楊酸乙醇溶液各2.0mL，然后加入10mg/mL樣品液2mL，最后加入2mL 8.8mmol/L H2O2。對照液中樣品液由去離子水替代，并于37℃下保持恒溫30min。以蒸餾水為空白，用可見分光光度計在510nm處測定其吸光值。

對OH·清除率的公式如式(3)：

(3)

式(3)中：OD0——空白對照液吸光度值；ODx——加入樣品液后吸光值；ODx0——樣品的本底吸光度值

(4)

1.4 數據統計及分析

至少進行3次試驗，利用Origin9.1軟件、OMNIC軟件包等進行數據分析，圖表處理及圖譜分析處理。

2 結果與分析

2.1 反應時間對糖基化反應接枝度和褐變程度的影響

圖1表明，產物的接枝度在反應進行過程中逐漸增加。這是因為，在初期，蛋白質鏈上的ε-氨基基團并未完全暴露，隨著糖基化反應時間延長，ε-氨基基團不斷暴露出來，與還原性羧基末端發生反應程度增加，從而增加產物的接枝度[11-12]。游離氨基和還原性羰基之間產生的化學反應同時也能提高產物的褐變程度。美拉德反應的高級階段涉及Amadori產物的降解，和生成被稱為“類黑精”的有色的高分子化合物[13]。同時，褐變程度也在反應進行的過程中逐漸增加，這表明有部分美拉德反應的高級產物生成。

圖2為90℃條件下反應的接枝度先迅速增加而后增加速度變緩，這是因為，溫度過高在促進蛋白和多糖之間反應的同時，也使蛋白質之間發生了一定程度的聚集，從而不利于反應的繼續進行。隨反應時間延長產物的褐變程度急劇增加，這表明90℃下美拉德反應的高級產物生成量逐漸增加。反應時間過長導致產物出現不良的色澤和氣味，這會限制其在食品工業中的應用，因此，控制反應的時間和溫度在一定范圍內是十分必要的。

2.2 還原力

由圖3可知，產物的還原力隨著反應時間的延長緩慢升高。研究表明，美拉德反應初級階段的Amadori熱解產物[14-15]、中間產物還原酮[16]、高級階段產物裂解形成“類黑精[17]”都具有一定的還原能力，此外，焦糖化反應產物也具有一定的還原能力[18]。其中，中間產物還原酮是起到還原能力的主要物質[19]。80℃條件下隨著反應時間延長，產物接枝度不斷增大，中間產物還原酮積累增多，因此，產物的還原力不斷增大。Limsuwanmanee J等[18]研究發現，美拉德反應產物中羥基基團的存在與其還原性呈相關性。Daglia等[20]研究表明，美拉德反應產物是一種特殊的由許多不同分子量的化合物組成的物質，特別是高分子量化合物。這種高分子量化合物是使產物表現出抗氧化性質的主要物質。由圖4可知，在反應開始1h內產物的還原能力增加較小，隨反應時間延長還原力迅速上升，并在反應4h后達到峰值，繼續延長反應時間，產物還原力有略微的下降，但仍處于較高水平。整體上90℃下產物的還原能力較80℃條件下產物有所提高，這可能是由于90℃下美拉德反應速率提高，產物褐變程度進一步增大，美拉德高級產物積累由此增多而導致。有研究表明，高級美拉德產物中的這些羥基基團也是使其表現出還原能力的重要物質[16]。反應時間繼續延長，產物還原力下降，這可能是因為過度熱處理一部分具有還原能力的產物分解所致。

2.3 DPPH自由基清除能力

圖5結果表明，在美拉德反應過程中，中間產物和終產物“類黑精”均可作為氫供體，其中高級階段產物“類黑精”主要起消除自由基作用[21-22]。隨著美拉德反應時間延長，產物的褐變程度逐漸增強，DPPH自由基清除能力也隨之增大。圖6結果表明，在反應開始1h內，DPPH自由基清除能力上升幅度較小，反應2h后急劇增加，反應進行到3h時，產物DPPH自由基清除能力達到峰值，之后DPPH自由基清除能力緩慢下降。研究表明，高級階段產物“類黑精”主要起清除自由基作用。在反應開始階段，DPPH自由基清除能力提升并不明顯，這是由于美拉德反應高級階段產物生成量有限；隨著時間延長，高級產物積累增多，DPPH自由基清除能力隨之增大，但反應時間過長，DPPH自由基清除能力也會下降，這可能是由于過度的熱處理，蛋白質發生劇烈聚集，不利于自由基清除反應的發生。90℃下產物相比于80℃反應產物DPPH清除能力有所提高，這是由于90℃下產物反應程度更高，在美拉德反應過程中積累了更多高級產物“類黑精”。但整體而言，MBPI-葡聚糖共價復合物DPPH自由基清除能力水平略低。有報道稱，DPPH自由基是一類相對疏水的自由基，較難作用于蛋白質、多糖類大分子，從而導致其難以與MBPI及MBPI-葡聚糖共價復合物作用，使樣品整體的DPPH自由基清除處于較低水平[23]。

2.5 羥自由基(·OH)清除能力

由圖9、10可知，90℃下產物反應開始1h時，·OH清除能力迅速提升，之后隨著反應時間的延長呈現先緩慢上升而后下降的趨勢，反應4h時產物的·OH清除能力達到峰值，為未處理MBPI的1.46倍，隨著反應時間的延長，·OH清除能力出現下降，研究發現是由于美拉德反應產物中具有·OH清除能力的物質在長時間高溫加熱的環境下被熱分解。反應一定時間后80℃與90℃產物的·OH清除能力相當，表明糖基化反應產物對·OH清除能力的影響有限。整體上MBPI-葡聚糖共價復合物的·OH清除能力高于MBPI，原因可能是，MBPI與葡聚糖共價結合后導致分子量變大以及螯合Fe2+的能力增強，使MBPI無法產生羥自由基，進一步阻斷了反應的繼續進行，最終表現為其清除能力的增強[24]。

圖1 80℃下反應時間對接枝度及褐變程度的影響

圖2 90℃下反應時間對接枝度及褐變程度的影響

圖3 80℃下反應時間對MBPI-Dextran共價復合物還原力的影響

圖4 90℃下反應時間對MBPI-Dextran共價復合物還原力的影響

圖5 80℃下反應時間對MBPI-Dextran共價復合物DPPH自由基清除能力的影響

圖6 90℃下反應時間對MBPI-葡聚糖共價復合物DPPH自由基清除能力的影響

圖7 80℃下反應時間對MBPI-Dextran共價復合物超氧自由基清除能力的影響

圖8 90℃下反應時間對MBPI-Dextran共價復合物超氧自由基清除能力的影響

圖9 80℃下反應時間對MBPI-Dextran共價復合物DPPH自由基清除能力的影響

圖10 90℃下反應時間對MBPI-Dextran共價復合物DPPH自由基清除能力的影響

3 結論

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(責任編輯 李婷婷)

The Inoxidizability of Mung Bean Protein with Dextran Glycosylation Process

JIANG Lian-zhou，ZHANG Xiao-yuan，WU Dan，ZHANG Wan-kun，ZHANG Jing，LU Yan，QUAN Wei-cheng，MI Si，LIU Shuang，WANG Zhong-jiang
(College of Food Science，Northeast Agricultural Univeristy，Harbin 150030，China)

mung bean protein；dextran；glycosylation process；inoxidizability

國家自然科學基金面上項目(項目編號：31671807、3157101375)；十三五重點研發專項“中華傳統食品工業化加工關鍵技術研究與裝備開發”(項目編號：2016YED0400402)；方便即食豆制品制造關鍵技術研究及新產品創制(項目編號：2016YFD0400702)；霍英東教育基金會高等院校青年教師基金(項目編號：20152325210002)。

江連洲(1960— )，男，博士，教授，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程。

王中江(1987— )，男，博士，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程。