亞甲基四氫葉酸還原酶MTHFR基因C677T多態性與食管癌預后的關系

劉芳+譚榜憲+彭小東+杜國波+蔣琳

【摘要】 目的：旨在探討亞甲基四氫葉酸還原酶MTHFR基因C677T多態性與食管癌生存期的關系。方法：收集155例在川北醫學院附屬醫院確診的食管鱗癌患者，調查患者的生活習慣并收集病理資料，采用限制性片段長度多態檢測（PCR-RFLP）的方法檢驗研究對象的MTHFR基因型，使用Pearon 字2檢驗評估MTHFR基因C677T多態性與食管癌患者性別、年齡、吸煙、飲酒、食用水果習慣、病變長度等臨床資料及病理特點之間的關系。用Kaplan-Meier方法和Cox回歸模型分析基因型與患者總生存時間之間的相關性。結果：攜帶MTHFR三個不同基因型（突變型、野生型、雜合型）的總生存時間比較差異無統計學意義（P=0.462），而淋巴結轉移陽性食管癌患者的總生存時間比較明顯短于淋巴結轉移陰性者（P=0.000），TNM分期Ⅲ期食管癌患者的總生存時間明顯短于Ⅲ期以下者（P=0.002）。多變量Cox回歸分析發現淋巴結轉移、TNM分期是影響食管癌生存時間的獨立風險因素（P<0.05），而性別、年齡、吸煙、飲酒、水果習慣、UGIC史、病變長度、首發癥狀、病變長度、MTHFR基因C677T多態性與食管癌的預后無關。結論：MTHFR基因C677T單核苷酸多態性可能與食管癌患者的預后無關，淋巴結轉移和TNM分期可以提示預后。

【關鍵詞】 食管癌； 多態性； MTHFR； 預后

【Abstract】 Objective：To discuss the relationship between methylenetetrahydrofolate reductase（MTHFR） C677T polymorphism and the prognosis of esophageal cancer.Method：A total of 155 patients with esophageal squamous cell carcinomas which were diagnosed in Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College.Survey patients' habits and collect their pathological data.MTHFR C677T polymorphism in these patients were determined by Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism（PCR-RFLP）methods.Pearon chi-square was used to discuss the relationship between MTHFR gene C677T polymorphisms and the clinical data and pathological characteristics，such as patients gender，age，smoking，drinking，eating fruit habits，length of lesion and so on.Kaplan Meier method and Cox regression model were used to analyze the correlation between genotypes and total survival time of patients.Result：Overall survival（OS） of patients with MTHFR gene C677T mutation type TT，OS of patients with wild type CC and MST of patients with hybrid type CT were not significant different（P=0.462）.OS of patients with lymph node metastasis was lower than that with negative lymph node metastasis（P=0.000）.OS of patients in stage Ⅲ was significantly was lower than that of below stageⅢ（P=0.002）.Cox multivariate analysis showed that lymph node metastasis and TNM stage were risk factors influencing survival（P<0.05）.However，gender，age，smoking，drinking，habits of fruit，UGIC history，length of lesion，original symptom and MTHFR C677T polymorphisms were not related to the prognosis of patients with esophageal cancer.Conclusion：Polymorphisms of MTHFR C677T may have nothing to do with the prognosis of patients with esophageal cancer.Lymph node metastasis and TNM stage may be potential prognostic factors to esophageal cancer patients.

【Key words】 Esophageal cancer； Polymorphisms； MTHFR； Prognosis

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.20.001endprint

我國是世界上食管癌發病率和死亡率最高的國家，在中國十大惡性腫瘤死亡率中，食管癌死亡率居第四位，中國食管癌死亡人數占全球的51.7%[1]，我國90%以上為鱗狀細胞癌。2012年，全球大約有456 000例新發病例和400 000例死亡病例，其中約半數的病例發生在中國[2-3]。手術治療是食管癌的主要治療手段之一，但食管癌預后差，中晚期患者治療后5年生存率不足20%[4]。臨床中常常發現即便是相同的病理類型和分期的患者接受相同的治療方案后，其治療后生存率仍存在巨大的差異，提示個體的遺傳因素可能在食管癌治療效果和預后等方面起著重要的作用。

MTHFR是葉酸代謝和DNA甲基化過程中的限速酶，MTHFR基因在人群中具有高的單核苷酸多態性（SNP），其中最常見的是677位點上C→T的改變。該突變導致丙氨酸轉化為纈氨酸，從而導致酶的活性改變[5]。SNP作為一種常見的遺傳變異，可導致個體表型的差異以及不同個體對疾病的易感性，以及對環境因素和藥物及治療反應的差異。MTHFR677C-T多態性與患者的預后的關系在不同類型的惡性腫瘤有不同的結果[6-8]。有研究發現，結直腸癌、乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、肺癌、胃癌、食管癌等腫瘤的預后可能與MTHFR基因多態性有關[9]。本研究擬通過分析MTHFR677多態性與食管癌手術治療患者預后生存的相關性，探討影響食管癌預后的因素，為食管癌治療效果的評估提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從2012年8月開始收集川北醫學院附屬醫院胸外科確診為食管鱗癌患者共155例。從手術之日開始隨訪，隨訪截止時間為2015年9月。所有研究對象均自愿參加調查，并在確診后接受面對面的流行病學問卷調查。吸煙定義為每天至少一支，持續6個月以上。飲酒定義為每周飲用至少一次并持續6個月以上[10]。食用水果習慣定義為每日攝入水果至少一次并持續1年以上。將有一名以上一級親屬和/或兩名以上二級親屬患食管癌/賁門癌/胃癌的患者定義為上消化道腫瘤（upper gastrointestinal cancer，UGIC）家族史陽性[11]。患者在手術前采用真空抗凝采血管收集外周靜脈血5 mL，-80 ℃超低溫冰箱長期保存用于基因組DNA提取。所有患者術前均未行過放療、化療等抗腫瘤治療，所有患者術前進行全面檢查排除遠處轉移，手術方式為食管切除和區域淋巴結清掃，食管胃胸頂或頸部吻合，常規清掃的淋巴結：氣管隆突下淋巴結、食管旁淋巴結、左下肺靜脈淋巴結、左下肺韌帶淋巴結、左肺動脈淋巴結、賁門旁淋巴結和胃周淋巴結。

1.2 MTHFR基因C677T多態性分析 采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度（PCR-RFLP）的方法進行基因多態分析，MTHFR基因C677T位點的PCR引物序列，上游引物‘TGAAGGAGAAGGTGT CTG CGG GA，下游引物‘AGGACGGTGCGGTGAGAGTG[12]，25 μL擴增反應體系中包含12.5 μL Go Taq Green Master Mix 2×，2.5 mL DNA模板，8 μL Nuclease-Free Water和引物各1 μL，反應條件為94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環34次，最終72 ℃延伸7 min，產物為194 bp。然后取5 μL PCR產物，加入9 mL Nuclease-Free Water，1 μL 10×Buffer Tango，1 μL限制性內切酶Hinf I限制性內切酶，建立16 μL的反應體積，混勻后離心9 s，置于37 ℃水浴箱中水浴孵育12 h。酶切反應結束后，取8 μL酶切產物，加樣于已混有Goldview染色劑3%瓊脂糖凝膠中電泳（100 V電壓，1×TAE電泳緩沖液）40 min，待電泳結束后，以凝膠成像分析儀觀察分析電泳結果。突變基因型TT有兩個條帶（175 bp and 23 bp），雜合基因型CT有三個條帶（198 bp，175 bp and 23 bp），野生型CC有一個條帶198 bp，由于23 bp條帶太小無法顯示，見圖1。

1.3 統計學處理 使用Pearon 字2檢驗評估3個位點基因型分布同食管癌患者性別、年齡、城市農村、UGIC家族史、首發癥狀等臨床資料及病理特點（腫瘤病變長度、淋巴結轉移與否、TNM分期）的關系。使用Kaplan-Meier法進行單因素生存分析，通過log-rank檢驗比較不同生存率間的差異。使用Cox回歸模型校正年齡、性別、吸煙、飲酒、分化程度等因素進行多因素生存分析。本次研究的數據統計分析使用SPSS 20.0軟件包完成，所有統計學檢驗均是雙側的，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象基本特征 155例食管鱗癌患者，男95例（61.3%），女60例（38.7%），年齡38～82歲，平均（61.79±7.35）歲，中位年齡62歲。所有研究對象均行手術治療，且有明確的術后病理報告記錄。到生存隨訪截止時間為止，63例死亡，2例失訪，中位生存期為35.11個月。

2.2 MTHFR基因型與食管癌的關系 本研究將患者分為男性組和女性組，比較MTHFR三個基因型在兩組間的差異，結果發現MTHFR突變基因型（TT）和雜合基因型（CT）在男性組的比例略高于女性組，但差異無統計學意義（P=0.299）。進一步將TT和CT兩個基因型合并后分析，差異無統計學意義（P=0.102）。155例患者中，年齡大于60歲者85例，60歲及以下者共70例，三個基因型在兩組間分布差異無統計學意義（P=0.361）。農村患者占本研究的83.9%，但是城市食管癌患者和農村食管癌患者在MTHFR基因型的分布差異無統計學意義（P=0.228）。155例患者中，55.5%的患者有吸煙史，飲酒者占46.5%，未發現吸煙、飲酒組的MTHFR基因型比較差異有統計學意義（P<0.05）。還調查了患者食用水果的習慣，研究發現有食用水果習慣的患者占了大多數（66.5%），MTHFR三個基因型在兩組間差異無統計學意義（P>0.05）。但是，將TT和CT兩個基因型合并后分析，發現含突變基因的基因型在無食用水果習慣組的比例更高，差異有統計學意義[P=0.04，95%CI（1.052，4.071）]。根據食管癌患者術后病例報告，發現155例患者中，67例淋巴結轉移陽性患者，88例淋巴結轉移陰性者。根據有無淋巴結轉移，將食管癌分為兩組來比較MTHFR基因型的差異，差異無統計學意義（P=0.657）。本研究數據顯示，食管癌病變長度從1～9 cm不等，分為≤4 cm和>4 cm，研究發現MTHFR基因型在兩者間分布差異無統計學意義（P=0.322）。根據2009年UICC的TNM分期，155例患者中，0期4例，Ⅰ期27例，Ⅱ期30例，Ⅲ期94例，Ⅳ期0例。將其分為Ⅲ期以前61例，Ⅲ期94例，兩者MTHFR基因型分布上差異無統計學意義（P=0.714）。見表1～2。endprint

2.3 生存分析結果 155例入組患者的中位生存時間為35.11個月，男性、女性總生存時間比較差異無統計學意義（P=0.985），年齡≤60歲和>60歲總生存時間比較差異無統計學意義（P=0.392），城市、農村患者總生存時間比較差異無統計學意義（P=0.200）。由表3可知，吸煙、飲酒患者的總生存時間分別短于不吸煙、不飲酒，但差異均無統計學意義（P>0.05）。有無水果習慣總生存時間比較差異無統計學意義（P=0.559）。研究有無UGIC史生存期發現，有UGIC史患者總生存時間短于無UGIC史患者，但差異無統計學意義（P=0.395）。吞咽困難者與其他表現者生存狀況比較，差異無統計學意義（P=0.196）。病變長度≤4 cm和>4 cm總生存時間比較，差異無統計學意義（P=0.617）。本研究發現，有淋巴結轉移食管癌患者的中位生存時間為33個月，無淋巴結轉移者中位生存時間為35個月。無淋巴結轉移者的生存期明顯長于有淋巴結轉移者，差異有統計學意義（P=0.000），生存曲線見圖2。而TNM分期在Ⅲ期以前的食管癌患者總生存時間短于Ⅲ期食管癌患者，差異有統計學意義（P=0.002），生存曲線見圖3。最后研究MTHFR三個基因型TT、CT、CC總生存時間均為35個月，三組的總生存期比較差異無統計學意義（P=0.462）。進一步采用Cox回歸模型校正年齡、性別、吸煙、飲酒、分化程度等因素進行多因素生存分析，因為淋巴結轉移和TNM分期存在相互影響，因此，將其分開納入方程，結果發現淋巴結轉移和TNM分期均是影響食管癌生存時間的獨立風險因素（P<0.05）。

3 討論

目前認為影響食管鱗癌患者預后的因素眾多，但還沒有一致的結論，主要包括TNM分期和患者一般狀況，如性別、年齡、家族史、體重指數、活動狀態（PS）評分和病變長度等。有研究發現高低發區、城市農村、腫瘤家族史、腫瘤部位、大體類型、分化程度對食管癌患者的預后影響，差異均無統計學意義（P>0.05），但是性別、診斷年齡與食管癌患者的預后有關。女性食管癌患者的中位生存期要大于男性（P<0.05），≤50歲的食管癌患者中位生存期大于50歲以上的患者（P<0.05）[14]。魏棟[15]學者研宄結果顯示年齡是食管癌患者預后的獨立影響因素，但是該研究發現青年組食管癌生存率低于老年組。有研究認為食管原發灶長度是食管癌預后重要指標[16]。Griffiths等[17]的研究顯示長度超過3.5cm的食管癌病變預后較差。Wang等[18]的研宄表明腫瘤長度是預后的獨立預測指標，腫瘤長度>4cm的食管癌患者總生存期縮短 。有一部分學者認為腫瘤的位置與食管癌的預后有關[19-21]。不過，也有研究持不同意見，一項大樣本研究結論認為性別、腫瘤部位與食管癌的預后無關，淋巴結轉移、遠處轉移、T分期與食管癌的預后有關[22]。一項針對中國的食管鱗癌研究認為，臨床因素如性別、年齡、吸煙、飲酒與食管鱗癌的預后無關。進一步研究認為食管鱗癌的部位（上段、中段、下段）與食管癌的預后無關，但是食管癌淋巴結轉移與否、有無遠處轉移、臨床分期與食管癌的預后有關。臨床分期3～4期的死亡率38%，明顯高于1～2期的死亡率20%（P<0.001）[23]。這與本研究的結論一致。本研究認為性別、年齡、吸煙、飲酒、水果習慣、UGIC史、首發癥狀、病變長度與食管癌的預后無關，而淋巴結轉移、TNM分期與食管癌的預后有關。可見，影響食管癌的因素很多，且不同的研究結果差異很大，這可能與樣本量的多少，食管癌的地域分布差異有關。而且，大多數臨床資料的收集都屬于回顧性收集，當患者確診后可能存在生活習慣的改變，最終導致研究結果的差異。但是，絕大多數研究都認為淋巴結轉移與否，TNM分期與食管預后有關。TNM分期是一個綜合分期，既考慮了原發灶的因素，也考慮到淋巴結侵犯和遠處轉移的情況，TNM分期是判斷預后的最重要的因素，在臨床上有十分重要的意義。因此，臨床工作中，準確的分期能夠為治療方案的優化、判斷預后提供標準。

目前有大量的研究討論MTHFR677位點的基因多態性與食管癌的易感性的關系。然而，MTHFR677位點的基因多態性與食管癌的預后的研究卻很少，且存在爭論[24-26]。 Sarbia 等[24]和Wu等[25]研究認為MTHFR677C-T多態性與食管鱗癌的預后有關。也有研究針對以5-Fu為基礎化療的食管癌患者認為，突變基因型TT存在生存獲益[27-28]。但是，一項在中國開展的食管鱗癌研究認為MTHFR677位點的基因多態性與食管癌的預后無關。本研究也未發現MTHFR677位點的基因多態性與食管癌的預后有關。有學者對印度北部人群的研究也沒有發現MTHFR677C-T多態性與食管鱗癌的預后有關[29]。一項對英國人群的分析同樣認為MTHFR基因型對食管癌的生存期沒有影響[30]。研究發現，MTHFR677C-T多態性在不同的人群中有很大程度的差異[31]。因此，不同種族，不同地區研究結果的不同，很大程度上是因為基因多態性的人群分布差異。

因此，期待更多大樣本、多中心的前瞻性研究來進一步探討影響食管癌的預后因素，同時開展更多MTHFR677C-T多態性與食管癌預后的研究，為食管癌的個體化精準治療提供參考。

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