丹參水溶性成分丹酚酸A對四氯化碳誘導大鼠肝纖維化的防治作用及機制

吳雄健++++++鄭虹++++++朱海燕++++++毛忠懿++++++謝軍

[摘要]目的 探討丹參水溶性成分丹酚酸A對四氯化碳誘導大鼠肝纖維化的防治作用及機制。方法 選取成年健康雄性SD大鼠48只，隨機分為假手術組、模型組、丹酚酸A組和Wnt通道阻滯劑組（DKK-1），每組各12只。除假手術組外均注射CCl4制作大鼠肝纖維化模型。丹酚酸A組于造模8周后給予丹酚酸A 10 mg/（kg·d）腹腔注射，Wnt通道阻滯劑組（DKK-1）于造模8周后予以DKK-1和丹酚酸A 10 mg/kg腹腔注射，而假手術組和模型組均于造模8周后予以等量生理鹽水腹腔注射。給藥治療6周后，處死各組實驗動物，收集肝右葉中部兩塊肝組織進行檢測，其中一塊利用10%的甲醛進行固定并制備石蠟切片；另一塊置于-70℃冰箱中保存備用，用于分子生物學檢測。結果 經Western blot檢測發現，模型組的α-SMA、TIMP-1和Collagen Ⅰ蛋白水平顯著高于假手術組，而丹酚酸A組和Wnt通道阻滯劑組（DKK-1）經相應的治療之后可以顯著下調上述指標的表達水平。模型組的α-SMA、MMP-2、TIMP-1、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ mRNA表達水平顯著高于假手術組，而丹酚酸A組和Wnt通道阻滯劑組（DKK-1）經相應的治療之后可以顯著下調上述指標的表達水平。模型組的Gsk3β、β-catenin表達水平顯著高于假手術組，β-catenin蛋白表達水平顯著低于假手術組，而丹酚酸A組和Wnt通道阻滯劑組（DKK-1）經相應的治療之后可以顯著下調Gsk3β、β-catenin的表達水平。結論 丹酚酸A可能是通過激活Wnt/β-catenin信號通路來抑制肝纖維化。

[關鍵詞]肝纖維化；大鼠；丹參；丹酚酸A

[中圖分類號] R-332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）10（b）-0004-04

[Abstract]Objective To explore the preventive effect and mechanism of salvianolic acid A of water-soluble component from Salvia miltiorrhiza on hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride in rats.Methods 48 adult male SD rats were selected and randomly divided into the sham group，the model group，the salvianolic acid A group，and the Wnt channel blocker group （DKK-1），with 12 rats in each group.Except the sham group，the CCl4 was injected in other three groups to establish hepatic fibrosis model in rats.In the salvianolic acid A group，10 mg/（kg·d） salvianolic acid A was intraperitoneally injected after 8-week modeling.In the Wnt channel blocker group，the DKK-1 and 10 mg/kg salvianolic acid A were intraperitoneally injected after 8-week modeling.For the sham group and the model group，the same volume of saline was intraperitoneally injected after 8-week modeling.The rats were sacrificed 6 weeks after medications.Two liver tissues from the middle of the right lobe of the liver were collected for test.One of them was fixed with 10% formaldehyde and prepared into paraffin sections.The other one was stored in a refrigerator at -70℃ for molecular biological detection.Results By Western blot detection，the expression of α-SMA，TIMP-1 and Collagen Ⅰ proteins in the model group was significantly higher than that in the sham group，while in the salvianolic acid A group and Wnt channel blocker group，the proteins expression mentioned above could be obviously down-regulated after the corresponding therapy.In the model group，the expression levels of α-SMA，MMP-2，TIMP-1，Collagen Ⅰ and Collagen Ⅲ mRNA were much higher compared with those in the sham group，while in the salvianolic acid A group and the Wnt channel blocker group，these indexes were greatly down-regualted after the related therapy.The Gsk3β and β-catenin expression levels in the model group were much higher than those in the sham group.The β-catenin expression level was extremely higher than that in the sham group.In the salvianolic acid A group and the Wnt channel blocker group，after the corresponding therap，the Gsk3β and β-catenin expression levels could be significantly down-regulated.Conclusion Salvianolic acid A may inhibit hepatic fibrosis by activating Wnt/β-catenin signal pathway.endprint

[Key words]Hepatic fibrosis；Rat；Salvia miltiorrhiza；Salvianolic acid A

肝纖維化是各種慢性肝炎發展為肝硬化的必經病理階段，嚴重影響肝臟的功能[1]，因此，采取有效藥物治療手段抑制或逆轉肝纖維化至關重要[2]。肝纖維化的發病機制很復雜，涉及多條信號通路的改變以及多種蛋白表達水平的變化。研究顯示，Wnt/β-catenin信號途徑與肺及腎纖維化的形成密切相關，但該通路與肝纖維化的關系尚不明確[3]。本研究利用丹酚酸A對大鼠肝纖維化模型進行干預治療，觀察丹酚酸A對四氯化碳（CCl4）致實驗性肝纖維化大鼠肝組織表達的影響，旨在為治療肝纖維化尋求新的治療靶點。

1材料與方法

1.1材料

成年健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠48只，體重200 g左右，均由廣東省農業科學院動物衛生研究所提供，許可證號：SYXK（粵）2016-0165。除假手術組外，大鼠輪替背部皮下及四肢內側注射40% CCl4橄欖油混懸液3 ml/kg體重，每周2次，共8周，以建立肝纖維化動物模型。

1.2方法

1.2.1分組及給藥 造模后8周，對大鼠實施隨機分組，分為假手術組、模型組、丹酚酸A組和Wnt通道阻滯劑組（DKK-1），每組12只，并進行不同的處理，各組具體給藥方式如下：假手術組和模型組單純采用等量生理鹽水腹腔注射；丹酚酸A組于造模8周后予丹酚酸A（蘇州巨能世紀信息科技有限公司）10 mg/（kg·d）腹腔注射；Wnt通道阻滯劑組（DKK-1，由上海江萊生物科技有限公司提供）于造模8周后予DKK-1和丹酚酸A 10 mg/kg腹腔注射。

1.2.2標本采集 給藥治療6周后，處死各組實驗動物，收集各組肝組織，稱取肝臟濕重，并切取肝右葉中部2塊肝組織進行檢測，其中一塊利用10%的甲醛（上海江萊生物科技有限公司）進行固定，制備石蠟切片；另一塊置于-70℃冰箱（由河北國輝實驗儀器有限公司提供）中保存備用，用于分子生物學檢測。

1.2.3觀察指標與檢測 ①肝纖維化相關指標的檢測：采用HE染色分析肝纖維化的程度，采用Isak評分系統對肝纖維化程度進行評分，采用免疫組化法觀察大鼠肝組織中MMP-2、TIMP-1、Tcf-4、α-SMA的表達，采用RT-PCR檢測大鼠肝組織中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、α-SMA mRNA的表達情況。②Wnt/β-catenin信號通路相關指標的檢測：采用免疫組化法觀察大鼠肝組織中β-catenin的表達，采用Western-blot檢測大鼠肝組織中β-catenin蛋白的表達，采用RT-PCR檢測大鼠肝組織中GSK-3β、β-catenin、Wntl、Wnt3α、Wntlob mRNA的表達情況。

1.3統計學處理

采用SPSS 19.0統計學軟件對實驗相關數據進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1四組α-SMA、TIMP-1和Collagen Ⅰ蛋白表達水平分析

經Western blot檢測發現，模型組的α-SMA、TIMP-1和Collagen Ⅰ蛋白水平顯著高于假手術組，而丹酚酸A組和Wnt通道阻滯劑組（DKK-1）經相應的治療之后可以顯著下調上述指標的表達水平（圖1）。

2.2各組α-SMA、MMP-2、TIMP-1、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ mRNA表達水平的比較

模型組的α-SMA、MMP-2、TIMP-1、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ mRNA表達水平顯著高于假手術組，而丹酚酸A組和Wnt通道阻滯劑組（DKK-1）經相應的治療之后可以顯著下調上述指標的表達水平（圖2）。

2.3各組Gsk3β、β-catenin蛋白表達水平的比較

模型組的Gsk3β、β-catenin表達水平顯著高于假手術組，β-catenin蛋白表達水平顯著低于假手術組，而丹酚酸A組和Wnt通道阻滯劑組（DKK-1）經相應的治療之后可以顯著下調Gsk3β、β-catenin的表達水平（圖3）。

3討論

肝病是一種常見疾病，會對人體健康造成不同程度的影響。肝纖維化是慢性肝病所共有的病理改變，是肝臟對慢性損傷的修復反應，被視為各種慢性肝病導致嚴重后果的共同途徑[4]。如何促進肝纖維化的逆轉，是預防和治療肝硬化的有效方法之一。

丹參是一種臨床應用較多的中藥之一，被廣泛應用于抗肝纖維化治療之中。丹參中含有的丹酚酸A是丹參的主要水溶性成分之一，在丹參水溶性成分中占有重要地位[5]。研究顯示，丹酚酸A具有很強的抗氧化、抗肝損傷、抗肝纖維化等作用[6]，可以通過清除超氧陰離子和羥自由基，抑制脂質過氧化反應，進而減輕肝損傷。魯珽等[7]的動物實驗顯示，針對CCl4致大鼠肝纖維化實施丹酚酸A注射治療效果確切，治療效果顯著優于口服50 mg/kg丹酚酸膠囊治療，可以發揮出更好的抗肝纖維化作用，能夠更好地改善實驗動物的臨床體征，并改善動物的肝臟器系數等指標。丹酚酸A可以抑制體外培養的成纖維細胞，激活膠原酶，促進膠原蛋白降解[8]。體內實驗顯示，丹酚酸A可降低CCl4慢性中毒大鼠的血清ALT、AST活性和肝組織丙二醛的含量，進而從整體上證實了丹酚酸A有顯著抗脂質過氧化肝損傷的作用[9]。另外，丹酚酸A還可降低肝臟羥脯氨酸的含量，減輕肝組織纖維化程度，抑制肝臟Ⅰ、Ⅲ型膠原沉積，具有顯著的抗肝纖維化作用[10]。丹酚酸A還可以抑制HSC的活化與增殖，減少ECM的合成，阻止肝纖維化的進程，因此，丹酚酸A可作為抗肝纖維化治療的有效藥物，丹酚酸A抑制肝星狀細胞增殖與膠原表達是其抗肝纖維化的主要作用機制[11]。通過本次研究發現，經Western blot檢測，模型組α-SMA、TIMP-1和Collagen Ⅰ蛋白顯著高于假手術組，而丹酚酸A組和Wnt通道阻滯劑組（DKK-1）經相應的治療之后可以顯著下調上述指標的表達水平。肝纖維化的出現是由人體內以Ⅰ、Ⅲ型膠原為主的細胞外基質合成與降解發生失衡現象所導致，正常情況下，人體的肝臟中細胞外基質在合成以及降解方面處于動態平衡的狀態[12]，其中，肝星狀細胞是合成細胞外基質的主要來源，在一定情況下，肝臟受損之后，肝星狀細胞便會發生一定的變化，被激活或轉分化為肌纖維母細胞[13]，進而表達大量的α-SMA及細胞珠蛋白，并分泌出大量的細胞外基質；同時，其可以通過正反饋的方式，對肌纖維母細胞的增殖產生明顯的調節作用[14]，而且在合成細胞外基質的同時，肝星狀細胞也會分泌大量對細胞外基質產生降解作用的基質金屬蛋白酶（MMPs）[15]。本次研究結果還顯示，模型組α-SMA、MMP-2、TIMP-1、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ mRNA表達水平顯著高于假手術組，而丹酚酸A組和Wnt通道阻滯劑組（DKK-1）經相應的治療之后可以顯著下調上述指標的表達水平；模型組Gsk3β、β-catenin表達水平顯著高于假手術組，β-catenin蛋白表達水平顯著低于假手術組，而丹酚酸A組和Wnt通道阻滯劑組（DKK-1）經相應的治療之后可以顯著下調Gsk3β、β-catenin的表達水平，提示丹酚酸A在治療β肝纖維化的過程中，發揮相關作用的機制可能是通過對經典的Wnt信號轉導通路予以抑制，進而促使肝星狀細胞增殖水平的下降，以及細胞外基質降解的增加來予以實現[16]。endprint

綜上所述，通過本次研究，從組織水平、蛋白水平和基因水平證實丹酚酸A可能是通過激活Wnt/β-catenin信號通路來抑制肝纖維化，從而為利用丹酚酸A治療肝纖維化提供新的治療靶點，為丹酚酸A在肝纖維化中的臨床應用提供了理論基礎。

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