肺癌組織及細胞中MED27的表達及意義

朱曉靜，許鵬飛，曹 彥，謝開鵬，唐冉冉

肺癌組織及細胞中MED27的表達及意義

朱曉靜1，許鵬飛2，曹 彥2，謝開鵬2，唐冉冉2

目的探討中介因子復合體(mediator 27, MED27)在肺癌組織樣本和肺癌細胞中的表達并進一步觀察MED27在肺癌細胞中的生物學功能。方法采用免疫組化法和Western blot法檢測MED27在70例肺癌組織以及5種不同肺癌細胞中的表達，分析MED27蛋白表達與肺癌臨床病理特征的相關性；設計沉默MED27基因的siRNA，利用Western blot法檢測MED27 siRNA在肺癌細胞中的沉默效率；CCK-8法檢測細胞增殖能力的變化，劃痕和Transwell實驗評估細胞的遷移和侵襲能力的變化；Western blot法檢測遷移侵襲相關蛋白的變化。結果免疫組化和Western blot檢測結果表明，MED27在肺癌組織以及肺癌細胞系中的表達水平明顯上調(P<0.05)。MED27表達與淋巴結轉移呈正相關(χ2=9.438，P=0.002，P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤T分期、遠處轉移等均無相關性(P>0.05)；利用小干擾RNA沉默MED27的表達，可以抑制H460細胞的增殖、遷移和侵襲(P<0.05)。同時，遷移相關蛋白MMP-2和MMP-9表達明顯下調，侵襲相關蛋白E-cadherin表達也明顯下調，而E-cadherin的負性調控蛋白Snail表達升高。結論MED27在肺癌組織和細胞系中高表達，且MED27陽性肺癌患者預后更差。沉默MED27的表達可以抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，以上結果提示MED27可以作為臨床肺癌基因治療的潛在靶標。

肺腫瘤；中介因子復合體27；遷移；侵襲

雖然肺癌的研究近年來已取得一定的進展，但是非小細胞肺癌的5年生存率并未顯著提高[5-6]。MED27作為一種重要的轉錄因子，在人體各組織中廣泛表達。目前，對MED27功能的研究主要集中在其轉錄調控方面。如MED27可以與甲狀腺激素受體相互作用，或通過與其它轉錄因子和輔因子結合一起行使甲狀腺激素受體功能[7]。但是，MED27在癌癥發生、發展中的功能和機制卻知之甚少。前期研究發現，MED27在黑色素瘤中異常高表達，可以作為評估黑色素瘤預后的潛在標志物[8]。本實驗擬通過分析MED27在肺癌組織中的表達和與肺癌患者預后的關系，以及MED27對肺癌細胞生物學功能的影響，闡明MED27在肺癌發生、發展中的作用，以期為肺癌的臨床靶向治療提供新的靶點和思路。

1 材料與方法

1.1臨床資料肺癌組織芯片購自上海芯超生物公司，含70例肺腺癌和對應的癌旁組織。所有的肺癌患者在手術之前均未行放、化療，腫瘤的邊緣組織經過病理證實無腫瘤侵犯為癌旁組織。其中，男性37例，女性33例；年齡36～83歲，中位年齡59歲；根據國際肺癌TNM標準分期：T1+T2者58例，T3+T4者12例；淋巴結轉移：N0+N1者44例，N2+N3者26例，遠處轉移M0者67例，遠處轉移M1者3例。

1.2實驗材料及主要試劑免疫組化試劑盒購自康為世紀公司，人肺癌細胞H1299、A549、H1975、H1437、H460均購自ATCC細胞庫，由本實驗室凍存保存及傳代培養，正常人支氣管上皮細胞(HBE)培養在10%的RPMI-1640中。DMEM細胞培養基和胎牛血清均購自Gibco公司，胰酶-EDTA購自Sigma公司；MED27人源的雙鏈siRNA由上海吉瑪制藥公司合成(siRNA1：上游5′-GGCUCCAAUUUG UCUAUAATT-3′，下游5′-UUAUAGACAAAUUGGAG CCTT-3′；siRNA2：上游5′-GGUGGCCAUAGUUCG AUAUTT-3′，下游5′-AUAUCGAACUAUGGCCACC TT-3′)，轉染使用的脂質體Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；Transwell小室和Matrigel購自美國BD公司，CCK-8購自東仁化學科技公司，BCA蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀公司，MED27、MMP-2、MMP-9抗體購自Santa Cruz公司(1 ∶500)；E-cadherin、Snail抗體購自Cell Signaling Technology(1 ∶1 000)，GAPDH購自Abcam公司(1 ∶1 000)，HRP標記的山羊抗兔IgG(H+L)與山羊抗鼠IgG(H+L)購自ProteinTech公司。

1.3方法

1.3.1免疫組化法檢測MED27在肺癌組織中的表達 免疫組化染色采用SP法，結果由兩位病理醫師分別獨立讀片。組織經二甲苯脫蠟，再通過梯度乙醇水化。微波爐中火10 min×5次進行抗原修復，3%H2O2孵育10 min，以消除內源性過氧化物酶活性。滴加山羊血清工作液室溫孵育10～15 min，以去除非特異性結合。一抗4 ℃孵育過夜，PBS漂洗，PV9000室溫孵育，DAB顯色，蘇木精復染，1%鹽酸、75%乙醇分化，1%氨水返藍，梯度乙醇脫水，封片。PBS代替一抗作為陰性對照，免疫組化結果判斷：本實驗根據細胞著色程度和陽性細胞占所觀察細胞百分比的評分乘積進行半定量。200倍顯微鏡下隨機選取10個無交叉重復的視野，每個視野計數100個腫瘤細胞，按細胞著色程度評分：無陽性著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。按陽性細胞占觀察細胞百分比評分：無陽性細胞為0分，≤20%為1分，21%～49%為2分，≥50%為3分。將兩項得分結果相乘：0分為陰性(-)，1～3分為弱陽性(+)，4～6分為中度陽性()，>6分為強陽性()。其中(-)定義為蛋白陰性，(+～)定義為蛋白陽性[5]。

1.3.2細胞的培養和傳代 顯微鏡觀察細胞生長密度，融合率達80%～90%時，吸去培養基，PBS緩沖液沖洗2次。加入1 mL胰蛋白酶液，置于37 ℃培養箱，并于顯微鏡下觀察細胞形態，當細胞收縮變圓時，加入2 mL培養基中止消化。輕輕吹打待細胞脫落，將細胞懸液轉移至15 mL離心管，1 000 r/min×5，棄上清，2 mL培養基重懸細胞，轉移至培養瓶中，加入5 mL培養基，5%CO237 ℃培養箱繼續培養。

1.3.3MED27siRNA轉染H460細胞 本實驗采用Lipofectamine 2000轉染siRNA，具體操作過程如下：按照常規細胞培養的方法培養H460，轉染前將對數生長的細胞接種于6孔板中，當細胞生長到融合度達70%～80%時進行細胞轉染；轉染前用無血清的培養基分別稀釋MED27siRNA和Lipofectamine 2000，混勻，在室溫下靜置5～10 min后；用無血清培養基清洗細胞2～3次后補加2～3 mL培養基，將之前混勻好的轉染混合試劑加入到培養板中進行轉染，6～8 h后棄去轉染培養液，加入新鮮的含血清不含雙抗的培養基繼續培養。

1.3.4CCK-8法檢測細胞增殖能力 取對數期生長的H460細胞，分別轉染對照和特異性的MED27siRNA 48 h以后，計數細胞：每100 μL細胞數為1 000～2 000個，加入到96孔板中，48 h以后，向每孔中加入10 μL CCK-8溶液，繼續培養1～2 h，酶標儀測定在450 nm處的吸光度(A)值。

1.3.5遷移和侵襲實驗 劃痕實驗：先用Marker筆在6孔板背后，采用直尺均勻劃得橫線，每隔0.5～1 cm一道，橫穿過孔。在孔中加入約5×105個細胞，37 ℃培養過夜；當細胞鋪滿，用槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜，用PBS洗細胞2～3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養基，轉染MED27siRNA 6～8 h，換正常培養基，放入37 ℃培養，按0、48 h取樣，拍照。Transwell實驗：小室上層加入1 mg/mL的基質膠20 μL后自然晾干，下層加入含20%血清的500 μL DMEM培養基，待細胞轉染后分別計數，用100 μL不含血清的培養基重旋3×106個細胞，加入到小室上層，小室在24孔板中繼續培養48 h后，4%多聚甲醛固定10 min后，用0.1%的結晶紫染色30 min后，倒置顯微鏡下拍照，計數。

1.3.6Western blot實驗 MED27siRNA轉染后繼續培養48 h，棄去培養液，RIPA裂解法提取蛋白，收集細胞總蛋白先進行定量，然后進行電泳，電泳完成后采用濕法進行轉膜，轉膜后用5%脫脂奶粉室溫下孵育封閉1.5～2 h，加入用抗體稀釋液稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜，用TBST漂洗，重復3次，每次10～15 min，加入HRP標記的二抗在室溫下孵育2 h，用TBST漂洗10 min×3次，采用ECL化學發光法顯影后進行機器曝光，采用相關圖像分析軟件進行圖像分析，測定灰度值，以GAPDH為內參照。

2 結果

2.1MED27在肺癌組織中的表達免疫組化染色結果顯示，70例肺癌組織中MED27的表達水平明顯高于癌旁組織(圖1)。70例肺癌組織中，MED27的陽性率為87.1%(61/70)，統計分析發現，MED27表達與淋巴結轉移呈正相關(χ2=9.438，P=0.002，P<0.05，表1)，與患者性別(χ2=0.809，P=0.369)、年齡(χ2=0.282，P=0.595)、腫瘤T分期(χ2=0.001，P=0.968)、遠處轉移(P>0.999)等無相關性(P>0.05，表1)，以上結果提示，MED27可能是肺癌的潛在標志物。

2.2MED27在人支氣管上皮細胞和肺癌細胞中的表達以人支氣管上皮細胞HBE為對照，通過Western blot法檢測MED27在不同肺癌細胞系中的表達。結果顯示，MED27在肺癌細胞系H1437、A549、H1299、H460中的表達水平顯著高于HBE細胞，表明MED27在不同類型肺癌細胞系中均異常高表達(P<0.05,圖2)。

AB

圖1MED27的表達：A.肺癌組織；B.癌旁組織，SP法

圖2MED27在不同肺癌細胞系和正常細胞中的表達：A.電泳圖；B.直方圖

表1 MED27表達與肺癌臨床病理特征的相關性

2.3沉默MED27對H460肺癌細胞增殖的影響鑒于MED27在H460細胞中表達量最高，且易轉染，因此選擇H460細胞作為后續研究對象。在轉染MED27siRNA 48 h以后，通過Western blot法檢測H460細胞中MED27的蛋白水平發現MED27的沉默成功(圖3A)。進一步通過CCK-8法檢測發現，沉默MED27可明顯抑制H460肺癌細胞的增殖(P<0.05，圖3B)。

2.4沉默MED27對H460肺癌細胞遷移和侵襲能力的影響采用劃痕實驗于0、48 h分別檢測沉默MED27對H460肺癌細胞遷移能力的影響，結果顯示，與對照組相比，MED27沉默后，H460肺癌細胞的遷移能力明顯降低(P<0.05)。Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力，結果顯示，MED27沉默組的侵襲能力同樣顯著低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，提示沉默MED27的表達可明顯抑制H460細胞的遷移(圖4A)和侵襲能力(圖4B)。

圖3 H460細胞轉染MED27siRNA后MED27的表達水平(A)及對細胞活力的影響(B)

圖4 沉默MED27的表達對H460細胞遷移(A)和侵襲(B)的影響

2.5MED27調控H460細胞遷移和侵襲相關蛋白的表達Western blot結果顯示：與siCtrl組相比，MED27siRNA組抑制了遷移相關蛋白MMP-2和MMP-9的表達，同時抑制了侵襲相關蛋白E-cadherin的表達，而E-cadherin的負性調控蛋白Snail的表達水平明顯升高(圖5)。

圖5 MED27沉默調控遷移(A)、侵襲(B)相關蛋白的表達

3 討論

隨著醫療水平的不斷提高，肺癌的治療手段也日益豐富，已發展為手術為主，化學藥物、放射、免疫等治療手段為輔的綜合性治療[9-11]，但仍未達到令人滿意的預后。隨著分子生物學理論和技術的飛速發展，隨著腫瘤生物治療研究的不斷加深和進步，基因治療現已成為肺癌治療的一種新模式，而理想的靶基因選擇則成為研究的熱點。鑒于各種人類腫瘤中一些中介復合物亞基(MED)的突變或過表達的出現，MED家族蛋白已在腫瘤發生、發展中發揮越來越重要的作用，如MED1和MED15在前列腺癌中異常高表達[12-13]，MED12的突變在子宮平滑肌肉瘤和結腸癌中是不良預后因素[14]。

MED27的研究尚處于起步階段，關于其和腫瘤的相關性更是少之又少。前期研究發現，抑制MED27的表達可以抑制黑色素瘤細胞的增殖，促進其凋亡，機制研究發現MED27可以調控腫瘤相關因子iNOS的表達，進而影響腫瘤的發生、發展[8]。因此，MED27可能在腫瘤的發生、發展過程中起重要作用。

總之，實驗結果初步表明MED27在肺癌組織和細胞中均異常高表達，且MED27的表達水平和肺癌患者的預后呈負相關，提示其可能影響肺癌的發生、發展。為此，通過細胞功能學實驗發現，沉默MED27的表達能夠明顯抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，而復發和早期轉移是導致其預后不良的主要因素，暗示MED27在肺癌中可能作為一種新的促癌不良因子，參與肺癌的進程。本組實驗結果為深入進行MED27的研究提供線索，發現了一種潛在的肺癌診斷和判斷預后的新標志物，有助于深入認識肺癌發生、發展的分子改變，但是MED27在肺癌中的臨床意義有待于進一步探索。

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ExpressionofMED27inlungcancertissuesandcellsanditssignificance

ZHU Xiao-jing1, XU Peng-fei2, CAO Yan2, XIE Kai-peng2, TANG Ran-ran2

(1DepartmentofPathology,JiangsuProvinceHospitalofIntegratedChineseandWesternMedicine,Nanjing210028,China;2MedicalResearchCenter,MaternityHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing210004,China)

PurposeTo investigate the expression level of MED27 in lung cancer tissue samples and lung cancer cell lines and to further study the biological function of MED27 in lung cancer cells.MethodsImmunohistochemistry and Western blot were used to detect MED27 expression in 70 lung cancer tissues and 5 different lung cancer cell lines, and the correlation between MED27 expression and gender, age as well as PTNM was also analyzed. The silence sequence of MED27 was designed by the siRNA technique. Western blot was used to detect the silence efficiency of MED27. The proliferation, migration and invasion ability of cells were assessed by CCK-8 assay, Scratch assay and Transwell assay after the MED27 was knocked down. Western blot was used to detect the expression of protein involved in the cell proliferation, migration and invasion.ResultsThe results of immunohistochemistry and Western blot showed that MED27 expression was higher in lung cancer tissues and cells (P<0.05). The expression of MED27 was positively correlated with lymph node metastasis (χ2=9.438,P=0.002,P<0.05). However, it was not related with gender, age, tumor size and distant metastasis (P>0.05). The knockdown of MED27 by MED27 specific siRNA could inhibit the proliferation, migration and invasion of H460 cells (P<0.05). The expression of MMP-2 and MMP-9 involved in the cell migration that were significantly inhibited in H460 cells transfected by MED27 siRNA, and the expression of E-cadherin, related with cell invasion was also decreased, while E-cadherin negative regulatory protein Snail was increased.ConclusionMED27 is highly expressed in lung cancer tissues and cells and high expression of MED27 predicts poor prognosis in lung cancer patients. The knockdown of MED27 inhibits the proliferation, migration and invasion ability of lung cancer cells. All of the above results suggest that MED27 is expected to be a candidate target of lung cancer gene therapy.

lung neoplasms; MED27; migration; invasion

R 734.2

A

1001-7399(2017)10-1086-06

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.10.006

肺癌已經成為男性發病率和病死率最高的腫瘤之一[1]，目前認為吸煙是肺癌最重要的高危因素[2]，除此之外，各種化合物、電離輻射、既往肺部感染、遺傳等因素也是導致肺癌的主要原因[3-4]。

時間：2017-10-23 13:30 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20171023.1330.006.html

接受日期：2017-08-13

國家自然科學青年基金(81702831、81402139)

1江蘇省中西醫結合醫院病理科，南京 210028

2南京醫科大學附屬婦產醫院醫學研究中心，南京 210004

朱曉靜，女，主治醫師。E-mail: zhuxiaojing0331@163.com

唐冉冉，男，碩士，助理研究員。E-mail: 13190186401@163.com